前言磷脂类物质参与细胞信号转导是近十余年来细胞信号转导研究领域的重大进展。鞘磷脂不仅是维持细胞膜结构的重要组分，而且其代谢产物还参与对细胞生长、分化、凋亡等多种生理活动的调节，其核心代谢产物神经酰胺在细胞凋亡过程中具有决定性作用，已成为判断细胞凋亡的特征性标志之一。近年研究表明，在放射线、热休克、化疗药物等刺激因素诱导肿瘤细胞凋亡过程中，细胞内源性神经酰胺可作为第二信使传递凋亡信号。体外研究发现，外源性神经酰胺可通过多种机制诱导肺癌、子宫内膜癌、结肠癌等肿瘤细胞发生凋亡。然而，目前关于神经酰胺在膀胱癌细胞凋亡过程中如何发挥作用还知道的很少。以往研究表明，作为细胞“动力工厂”的线粒体在细胞凋亡过程中也扮演重要角色。线粒体内含有多种与细胞凋亡密切相关的细胞因子，如细胞色素C、凋亡诱导因子、Smac／Diablo、硫酸氧化酶等。在凋亡刺激因素作用下，线粒体渗透性发生变化或外膜破裂，这些细胞因子将释放入胞浆内使凋亡信号得以放大，最终导致细胞凋亡。有学者将由线粒体所介导的细胞凋亡通路称为细胞凋亡的“线粒体通路”。神经酰胺诱导人膀胱癌细胞凋亡过程是否借助于“线粒体通路”还是一个悬而未决的问题。化疗是膀胱癌手术后治疗的重要方法，但药物的毒副作用和肿瘤的耐药现象常给治疗带来不良影响，膀胱癌化疗的总体效果仍不能令人满意。药物之间的合理配伍可以发挥协同抑瘤作用，在提高治疗效果的同时降低药物浓度，从而减少药物毒副作用和肿瘤耐药现象的发生。传统化疗药物与神经酰胺联合应用若能够发挥协同抑瘤作用，则可为膀胱癌治疗提供一条新的方案。本研究共分3个部分对以上问题进行探讨。首先，探讨神经酰胺对人膀胱癌细胞的凋亡诱导作用及其可能的分子机制；然后以丝裂霉素C（MMC）为代表检测化疗药物与神经酰胺联合应用是否可以协同抑制人膀胱癌细胞生长；最后探讨MMC与神经酰胺发挥协同抑瘤作用的机制。材料与方法1、C₂-神经酰胺（C₂-Cer）对BIU-87细胞生长的抑制作用C₂-Cer处理BIU-87细胞，然后采用四甲基偶氮唑兰（MTT）法测定细胞生长的抑制率，抑制率=[(对照组A₄₉₀值-加药组A₄₉₀值)／对照组A₄₉₀值]×100％。2、协同效应检测试验共分4组：（1）丝裂霉素C（MMC）组：MMC终浓度分别为11.964、23.928、47.856、95.711、191.422μmol／L；（2）C₂-Cer组：C₂-Cer终浓度分别为2.500、5.000、10.000、20.000、40.000μmol／L；（3）联合用药组：同时加入MMC和C＿2-Cer，终浓度分别为：11.964和2.500、23.928和5.000、47.856和10.000、95.711和20.000、191.422和40.000μmol／1；（4）未经任何药物处理的细胞作为对照。MTT法检测细胞生长抑制率，计算公式：抑制率=[（对照组A值-试验组A值）／对照组A值]×100％。采用CHOU-TALALAY联合指数法判定药物之间相互作用的效果。3、细胞凋亡形态学检测收集经不同浓度MMC和C₂-Cer处理后的细胞，磷酸盐缓冲液洗2次，调整细胞浓度为1×10⁷个／mL。吖啶橙（AO）荧光染色，荧光显微镜下观察。4、细胞凋亡率检测收集经不同浓度MMC和C₂-Cer处理后的细胞，碘化丙啶（PI）染色法用流式细胞仪检测细胞凋亡，采集软件CellQuest 3.0，分析软件ModFit，结果用百分率表示。5、Caspase-3活性检测Caspase-3活性是依据底物DEVD-pNA被活性Caspase-3分解后产生的pNA单体在405nm波长的吸光度(A₄₀₅)值与Caspase-3活性成正相关而间接测定。收集经不同浓度MMC和C₂-Cer处理后的细胞按照试剂盒说明书操作，紫外分光光度计在405nm波长测定A₄₀₅值，以A₄₀₅值大小表示Caspase-3活性。6、细胞色素C亚细胞分布及Bcl-2蛋白表达水平变化的检测按照线粒体／细胞浆分离试剂盒说明书的步骤提取线粒体和细胞浆蛋白，参照文献提取细胞总蛋白。蛋白样品用考马斯亮蓝法进行定量。细胞总蛋白作Bcl-2蛋白含量分析，细胞浆和线粒体蛋白作细胞色素C含量分析。以40μg蛋白上样量进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜，抗体孵育、显色。对条带进行灰度扫描，以目的条带和内参照灰度的比值表示蛋白含量。7、统计学分析t检验或q检验。结果随C₂-Cer浓度增加，抑制率逐渐增加（表1-1）。抑制率与C₂-Cer浓度呈正相关（r=0.979，P＜0.05）。C₂-Cer处理后，可见细胞出现凋亡的特征性形态学改变（图1-1）。FCM检测BIU-87细胞凋亡率随C₂-Cer浓度增加而逐渐增加（P＜0.05）（图1-2）。随C₂-Cer浓度增加，Caspase-3活性逐渐增加。对照组细胞浆内细胞色素C表达阴性，细胞色素C仅存在于线粒体内。C₂-Cer处理组线粒体内细胞色素C含量显著低于列：照组（P＜0.05），同时在细胞浆内可检测到细胞色素C（图1-3）。对照组和C₂-Cer处理组均有Bcl-2蛋白表达，但C₂-Cer处理组表达水平显著低于对照组（P＜0.05）（图1-4）。MMC与C₂-Cer单独及联合应用对BIU-87细胞的生长均有抑制作用，随着药物浓度的增加，对细胞生长的抑制作用也增加（表2-1）。MMC、C₂-Cer合用时各自的中效浓度分别是单用时的35.0％和40.6％。MMC和C₂-Cer单独应用时的中效方程分别是：D=153.003（fa／fu）^0.771和D=26.644（fa／fu）^0.649，MMC和C₂-Cer联合应用时的中效方程分别是：D=54.325（fa／fu）^0.665和D=11.350（fa／fu）^0.665。在整个效应范围内两种药物均存在协同效应（CI＜1） （表2-2、图2-1）。两种药物在各浓度联合应用时的凋亡率均高于各自单用，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3-1、图3-1、3-2）。MMC、C₂-Cer单用和联合应用均可见部分细胞出现体积缩小，细胞核染色质固缩、聚集于核膜下或碎裂成数个黄绿色强荧光颗粒等凋亡的特征性形态学改变，联合用药表现最为明显（图3-3）。MMC、C₂-Cer单独和联合应用均可导致Caspase-3活性升高，联合用药Caspase-3活性升高更为明显（P＜0.05）。MMC、C₂-Cer单独及联合应用均可使线粒体内细胞色素C向细胞浆释放，导致线粒体内细胞色素C含量下降，MMC、C₂-Cer单独及联合用药时，BIU-87细胞线粒体细胞色素C含量均显著低于对照组（P均＜0.05），联合用药时线粒体细胞色素C含量显著低于MMC和C₂-Cer单独应用（P均＜0.05）（图3-4）。对照组细胞浆内细胞色素C阴性，MMC、C₂-Cer单独及联合用药细胞浆内均有细胞色素C出现，联合用药时细胞浆内细胞色素C含量显著高于MMC和C₂-Cer单独应用（P均＜0.05）（图3-5）。结论1、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平、促进线粒体内细胞色素C向细胞浆的释放和Caspase-3的激活可能是C₂-Cer诱导膀胱癌细胞凋亡的重要机制。2、MMC与C₂-Cer联合应用可以通过共同诱导细胞凋亡，协同抑制膀胱癌细胞生长。3、线粒体细胞色素C释放和Caspase-3激活可能在MMC与C₂-Cer协同抑制人膀胱癌细胞生长过程中发挥重要作用。