背景椎间盘退行性疾病是一种常见的严重影响人们生活质量的疾病,有流行病学研究结果表明,由椎间盘退变而引发的腰腿痛已成为世界上发病率最高的职业性疾病。我国每年投入500亿左右的花费用于椎间盘退行性疾病而引起的腰腿痛疾病,因此,开展椎间盘退变性疾病相关的临床及基础研究工作,具有重大的社会和经济价值。传统的治疗椎间盘退行性疾病的外科治疗方法无法解除疾病的发病因素,且可能导致原位或邻近椎间盘疾病的复发。另外由于髓核的生物力学功能复杂,目前临床应用的新技术难以完全模拟和替代椎间盘功能,而且存在有并发症和远期疗效不佳的问题,无法适应椎间盘早中期退变的治疗的要求。相比之下,采用干细胞治疗技术修复退变的椎间盘,是治疗早中期椎间盘退变的理想途径,也是目前研究的热点之一。随着对干细胞研究的不断深入,其在椎间盘退行性疾病中的应用越来越受到学者们的关注。目前,骨髓间充质干细胞是目前研究最常用的干细胞,其研究历史已超过50年。骨髓间充质干细胞在体内外能向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等多方向诱导分化,而且具有免疫豁免及抗炎等特性。此外,有学者已经证实骨髓间充质干细胞能向髓核样细胞分化；通过髓核细胞和骨髓间充质干细胞的接触培养,可上调髓核细胞的生物学活性；并且在动物模型中,证实了骨髓间充质干细胞具有延缓椎间盘退变的功能。但将骨髓间充质干细胞用于临床,仍存在许多问题,如供区局部的创伤、骨髓稀释及伦理问题等,因此激活髓核组织内源性干细胞,即所谓的“髓核间充质干细胞”的功能可能更有助于椎间盘退变的修复,为干细胞治疗椎间盘退行性疾病提供新的思路和研究方向。另一方面,为了解细胞移植后在体内的存活、迁徙、分布和转归等情况,需要使用适当的示踪技术将细胞加以标记,在体内对细胞进行识别和监测。示踪技术的进步直接制约着干细胞研究的发展与深入,如何选用合适的示踪技术辨别移植的干细胞一直是令研究者困扰的问题。由于组织学检测不能区别受体细胞与移植细胞,所以目前大多采用将干细胞体外标记后再移植入体内的方法。传统细胞标记方法包括荧光染料标记法、抗原标记法和荧光蛋白标记法等,其中标记细胞核标是常用的手段之一。EdU(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是新一代细胞核标记物,近年来越来越广泛的应用于检测DNA复制、细胞增殖以及细胞标记。与传统的免疫荧光染色检测方法相比,EdU检测方法具有更为简单、快速、准确,对细胞生长分化影响小的优势,在干细胞失踪方面具有良好的应用前景和发展空间。本实验以人髓核组织内分离培养的细胞为标本,依据干细胞鉴定规则对其进行鉴定,确认此细胞为间充质干细胞,并应用细胞核标记物EdU对其进行体外标记实验,为下一步动物实验奠定基础。目的1、分离培养髓核间充质干细胞,鉴定细胞表面标志并进行成骨、成脂和成软骨诱导分化,以判断和证实髓核中是否存在所谓的髓核间充质干细胞；2、通过使用不同抗体标记不同细胞表面标记物,并进行流式细胞仪分选,进一步证实分离培养的细胞为髓核间充质干细胞；3、使用不同浓度的EdU在体外标记获取的细胞,分别孵育24和48h后使用流式细胞仪检测其标记率,并筛选各时间点标记率最高的优化浓度组；4、对标记后的细胞进行细胞形态学观察并与未标记细胞进行对比,选择各时间点标记率最高的优化浓度组观察细胞形态学变化和标记率随时间下降情况；5、选择各时间点标记率最高的优化浓度组细胞绘制增殖曲线,并与未标记细胞组进行比较,判断EdU标记对细胞增殖的影响；方法1、术中取出成人髓核组织,无菌状态下去除骨、软骨及纤维环等组织,胶原酶消化分离培养髓核组织中的细胞。传至第3代时,观察其形态学,并依据国际细胞治疗协会(ISCT,International Society for Cellular Therapy)制定的标准观察细胞的贴壁情况、表面抗原CD73、CD90、CD105、HLA-ABC阳性,CD45、 CD34、HLA-DR阴性,以及成骨、成脂、成软骨诱导分化结果鉴定其是否为髓核间充质干细胞。然后使用不同标记方法对CD73、CD90以及CD105进行三重标记,并使用流式细胞仪分选。2、将培养的第3代细胞接种至96孔培养板内,培养至状态良好后分别加入含有终浓度为5、10、20、50、100μmol/L的EdU的培养基,对照组加入等量普通培养基100μ L,孵育24、48小时后固定细胞并进行染色,以Hochest33342染细胞核为背景。在荧光显微镜下观察细胞标记效果。3、将培养的第3代细胞接种至6孔板内培养至状态良好,分别加入含有终浓度为5、10、20、50、100μmol/L的EdU的培养基500μ L,对照组加入等量普通培养基。孵育24、48小时后收集细胞并进行染色,然后使用流式细胞仪检测各组标记率,筛选出各时间点标记率最高的优化标记组。4、将培养的第3代细胞接种至6孔板内培养至状态良好,按各时间点标记率最高的优化浓度组加入EdU培养基500μ L,对照组加入等量普通培养基,孵育24、48小时后弃培养基,加入普通培养基继续培养,依照标记后立即、3天、7天、10天,14天为时间点,显微镜下观察其形态变化以及记录其标记率变化。5、将培养的第3代细胞接种于96孔板,依照各时间点标记率最高的优化浓度加入EdU,对照组加入等量普通培养基,37℃分别孵育24、48小时后加入普通培养基继续培养,依照标记后即刻以及3天、6天、9天、12天为时间点,每次选择3个孔,加入CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂避光孵育2h,使用酶标仪检测吸光度值并依据绘制细胞生长曲线。结果1、经光学显微镜观察,原代培养的细胞在10天左右后可看到细胞贴壁,继续培养至约15天可见大部分细胞贴壁。单个细胞成长短不一的梭形,呈集落样生长,培养至70-80%融合时细胞排列成放射状或螺旋状,此时可按1：3进行传代。传代细胞单个呈均一的长梭形,排列有序,3-5天可生长至70-80%融合并排列为放射状或螺旋状,细胞呈多边形或者长梭形。2、传代至第3代的细胞,经流式细胞仪检测细胞表面标记物,其中CD73、CD90、CD105、HLA-ABC呈阳性表达,CD45、CD34、HLA-DR呈阴性表达。使用不同标记方法对CD73、CD90以及CD105进行三重标记,并使用流式细胞仪分选,结果阳性细胞率大于95%。成骨诱导21天后可观察到矿化钙结节,而且茜素红染色阳性；成脂诱导21天后可观察到细胞间隙内少量透明脂肪小泡,而且油红0染色阳性；成软骨诱导21天后切片可见切面呈软骨样组织,而且阿利新蓝染色阳性,证明培养的细胞可以成功进行三系诱导分化。3、标记组均可见EdU阳性细胞核为红色,Hochest染色背景细胞核为蓝色,对照组以及5、10、20、50、100μmol/L浓度组细胞阳性标记率逐渐增大,其中50μmol/L、24h组与20μmol/L、48h组标记率最高,各组间具有统计学差异(P<0.05)。4、标记组细胞与未标记组细胞形态无明显差异,各优化浓度组细胞继续培养传代3天、7天、10天,14天标记率不断降低,但降低幅度较小。标记组细胞与未标记组细胞的生长曲线均呈“S“形,各标记组细胞曲线均低于为标记组细胞曲线,部分时间点之间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1、人髓核组织中存在符合ISCT标准的间充质干细胞,可称为“髓核间充质干细胞”；2、流式细胞仪分选结果示,培养至3代的细胞内间充质干细胞含量超过95%；3、EdU可用于标记髓核间充质干细胞,标记率随标记物浓度及孵育时间增加而增加,50μmol/L、24h组和20μmol/L、48h组具有优秀的标记效果；4、EdU标记对细胞形态学无明显影响,标记后2周标记率无明显降低,标记对细胞增殖影响较小,其中50μmol/L、24h组最适合用于髓核间充质干细胞标记。综上所述,人髓核组织中存在髓核间充质干细胞,EdU适合用于标记髓核间充质干细胞,使用50μmol/L、EdU,37℃孵育24h,是体外标记人髓核间充质干细胞的最适条件。本实验筛选出使用EdU标记人髓核间充质干细胞的安全有效的条件,为下一步研究髓核间充质干细胞体内增殖、迁徙、转归等实验奠定基础。