严重创伤、大面积烧伤、肿瘤摘除、整形术后的创面覆盖一直是困扰临床医生的难题。目前常规的治疗方法有自体、异体或异种皮移植。自体皮肤来源极为有限,而且存在着形成新创面的缺陷;异体或异种皮肤移植解决了自体皮源不足的问题,但由于难以克服的免疫排斥反应,目前只能用作暂时封闭创面的覆盖物。近年来,组织工程皮肤的构建与应用为皮肤缺损的修复提供了极具发展潜力的治疗途径。但现阶段各种组织工程化皮肤移植存活率明显低于自体断层皮片,其首要原因之一是组织工程化皮肤移植后缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤。因此,如何促进移植皮肤的血管化,成为组织工程皮肤临床推广应用研究的关键。研究表明,利用转基因技术,将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,可有效促进血管生成。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells , MSCs )是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,在不同的诱导条件下可向骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞和内皮细胞等各种细胞系转化,由于骨髓间充质干细胞属未分化的前体干细胞,表型分化尚不成熟,免疫原性小,所以移植后无排斥反应或反应较弱,而且,骨髓间充质干细胞还具有取材方便、体外扩增容易、体外增殖能力强、易于基因操作等独特的优点,逐渐成为基因治疗适宜的细胞载体。血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)是目前已知的最强的促血管再生因子,近年来应用血管内皮细胞生长因子165基因(VEGF165)转染骨髓间充质干细胞,用于心肌缺血或肢体缺血性疾病的实验及临床研究已取得了令人瞩目的成就,但将其应用于组织工程皮肤构建的研究尚未见报道,因此,采用基因转移技术将hVEGF165基因转入骨髓间充质干细胞中,使其有效表达目的基因和蛋白,构建活性组织工程皮肤,植入皮肤创面后使骨髓间充质干细胞在局部短期内分泌VEGF蛋白,从而促进组织工程皮肤的早期血管化,有可能为解决组织工程皮肤血管化这一问题提供新的方法与思路。本研究采用脂质体介导hVEGF165基因转染人骨髓间充质干细胞,观察VEGF165基因mRNA转录、蛋白的表达情况及转染后对骨髓间充质干细胞的影响,并接种转染VEGF165基因的骨髓间充质干细胞于同种异体脱细胞真皮支架上构建VEGF基因修饰的活性皮肤替代物,移植修复动物全层皮肤缺损创面,观察其在皮肤结构和功能重建中的作用及其转归,比较缺损创面移植皮肤的血管化情况,为加速组织工程皮肤移植后血管化、提高其临床移植成功率探索新的途径。基于这种认识,我们开展了以下一系列研究:第一部分人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的:建立一种分离纯化和培养人骨髓间充质干细胞的方法,为利用骨髓间充质干细胞进行基因治疗提供实验基础。方法密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化人骨髓间充质干细胞。倒置相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞形态学变化;流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期;绘制人骨髓间充质干细胞的生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构。结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞CD90、CD29、CD44、CD34、CD45阳性表达细胞比率分别为98.48%、98.74%、97.41%、0.36%、0.64%。人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形。透射电镜示细胞核浆比大,可见部分细胞器和蛋白分泌物。结论采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效实用可行的方法。第二部分血管内皮细胞生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究目的:观察人骨髓间充质干细胞转染VEGF165基因后外源性基因及其蛋白的表达,探讨其促进组织工程皮肤移植后血管化的可能性。方法体外分离、培养人骨髓间充质干细胞,采用脂质体介导方法将pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染人骨髓间充质干细胞,并设立空质粒对照组(转染pShuttle-CMV载体)、脂质体对照组(转脂质体)和正常对照组(无特殊处理),用RT-PCR、ELISA和Western Blot检测人骨髓间充质干细胞VEGF165 mRNA及其蛋白的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测VEGF质粒转染对骨髓间充质干细胞活性的影响。结果:RT-PCR检测结果显示:质粒转染实验组、空质粒对照组、脂质体对照组和正常对照组VEGF165基因mRNA表达量分别为0.89±0.03、0.34±0.04、0.40±0.03、0.30±0.03。质粒转染实验组骨髓间充质干细胞mRNA转录较三个对照组均显著上调(P <0.01)。ELISA检测质粒转染实验组、空质粒对照组、脂质体对照组和正常对照组处理后24h细胞上清hVEGF的浓度分别为778.39±35.21 pg/ml、543.55±24.32pg/ml、561.45±28.08pg/ml、571.53±22.73pg/ml,质粒转染实验组与其他对照组相比具有统计学差异(P<0.01)。质粒转染后第7天表达达到最高,以后再逐渐降低。Western Blot检测结果显示转染组条带明显增强(P<0.01)。MTT法及凋亡检测结果显示VEGF质粒转染对骨髓间充质干细胞增殖无影响。结论实现了VEGF165基因对人骨髓间充质干细胞的成功转染,并有效表达目的基因及其蛋白,具有促进组织工程皮肤移植后血管化的应用前景。第三部分血管内皮细胞生长因子165修饰骨髓间充质干细胞复合脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤目的:以VEGF修饰的骨髓间充质干细胞复合脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤,为进一步临床应用奠定基础。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,以脂质体介导pShuttle-CMV/ VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞后,将其接种于制备好的脱细胞真皮支架上,构建组织工程皮肤,观察细胞生长情况及其与支架材料的相容性。结果:脱细胞真皮基质去细胞完全,组织相容性好,转基因骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好,可体外构建组织工程皮肤。结论:利用VEGF修饰骨髓间充质干细胞及制备的脱细胞真皮基质可以体外联合构建活性组织工程皮肤。第四部分含基因骨髓间充质干细胞的活性皮肤移植促进组织工程皮肤血管化的初步研究目的:探讨含基因骨髓间充质干细胞的活性皮肤移植促进组织工程皮肤血管化的基因治疗的可行性。方法:新西兰白兔26只,于兔背部两侧常规全层皮肤缺损创面4个,随机分为四组:A组(以含VEGF基因骨髓间充质干细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤修复创面,hVEGF165-MSCs+ADM实验组),B组(以骨髓间充质干细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤修复创面,MSCs+ADM对照组),C组(以不含细胞的脱细胞真皮修复创面,单纯ADM对照组)和D组(创面不做处理),观察局部组织微血管密度变化及创面愈合情况。结果:移植术后一周, hVEGF165-MSCs+ADM实验组创面的毛细血管密度较MSCs+ADM对照组、单纯ADM对照组明显增高(P < 0.01),两周时三组中hVEGF165-MSCs+ADM实验组的血管密度仍最高,但三组数据无统计学差别。术后2周、3周hVEGF165-MSCs+ADM实验组移植物成活率较MSCs+ADM对照组、单纯ADM对照组高(P < 0.01),hVEGF165-MSCs+ADM实验组创面收缩率较MSCs+ADM对照组、单纯ADM对照组高低(P < 0.01)。结论:含基因骨髓间充质干细胞的活性皮肤移植可有效促进组织工程皮肤的早期血管化及改善创面愈合。