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食管癌是我国常见的恶性肿瘤,多数患者就诊时为晚期,而传统的手术治疗、放疗、化疗对转移和再发的晚期肿瘤治疗效果差,而且对病人有较大的毒副作用,因而肿瘤的基因治疗有望成为一种新的治疗策略。在肿瘤基因治疗研究中,令许多学者关注的是HSV-tk/GCV自杀基因系统。HSV-tk/GCV治疗肿瘤的基本机制包括:(1)“自杀效应”:HSV-tk可将无毒的抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(GCV)磷酸化为细胞毒性产物,抑制DNA聚合酶活性或作为DNA链延伸的终止子,阻止DNA合成,导致细胞死亡。(2)“旁观者效应”:即使仅有10%或更少的肿瘤细胞被转入tk基因,当加入GCV后,其余的肿瘤细胞由于细胞间的缝隙连接和信号传递也将被杀死。旁观者效应极大地提高了HSV-tk基因抗肿瘤活性,由此所发展起来的HSV-tk/GCV自杀基因体系已成为恶性肿瘤基因治疗中较为有效和具有临床应用前景的治疗方法之一;但迄今为止,有关HSV-tk基因对食管癌的作用研究在国内未见报道,在国外报道也很少。本研究利用自杀基因HSV-tk,构建了重组的真核表达载体,并利用脂质体法转染食管癌细胞株,经G418加压筛选,最终得到抗G418的抗性细胞克隆,并且通过RT—PCR鉴定了HSV-tk基因在食管癌细胞株中的表达,为食管癌的自杀基因研究提供实验依据。 1.方法 1.1 HSV-tk基因真核表达载体的构建 将质粒pBabe-tk转化感受态大肠杆菌JM109,挑取阳性菌落,提取质粒DNA,郑州大学2004届硕士学位论文HSV-水基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞株中的表达经BamHI酶切质粒,1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化约1 1 OObP的tk基因。同时用BamHI酶切真核表达载体pcDNA3,胶回收线性化载体,为了防止载体的自身环化,用碱性磷酸酶除去酶切载体5’端的磷酸,并用酚/氯仿抽提纯化去磷酸化载体。1%琼脂糖凝胶电泳定量回收的tk基因片段和纯化后的去磷酸化载体,确定连接反应体系,在T4 DNA连接酶作用下,16℃过夜连接。取连接产物转化感受态大肠杆菌脚109,并接种于Amp+抗性琼脂培养皿,挑选阳性重组子。 1.2重组载体的鉴定 取阳性克隆菌液,提纯质粒后用Ba耐11酶切鉴定目的基因是否插入。因为是单酶切后连接,而非双酶切的定向连接,所以必需对插入片段的插入方向进行鉴定。根据EcoRv酶切正反向连接产物后的片段大小不同来鉴定其方向,连接方向正确的表达质粒被命名为pcDNA3一tk,并用Sp6引物做反向测序以进一步证实。 1.3转染食管癌细胞株 转染前一天,细胞换液,培养于无抗生素的生长培养基中,待细胞生长至90%细胞融合时转染,以1 x 105个细胞/孔接种于24孔培养板中,转染方法按Promega公司提供的Lipofectmine说明书进行。转染分两组,分别转染重组载体PcDNA3一tk与空载体PcDNA3,同时留未转染细胞作对照。转染后的细胞在含10%小牛血清中于37℃,5%C仇条件下培养,48h后再用G418进行选择培养,得到抗G418的抗性细胞克隆。 1 .4 RT一PCR: 用RT一PCR方法鉴定HSV一tk基因在食管癌细胞中的表达。抽取食管癌细胞株总RNA,在胡V逆转录酶作用下,刚A逆转录为cDNA。按己报道的tk基因序列设计上游和下游引物,以逆转录的cDNA为模板进行PCR反应,同时加6一肌动蛋白引物作为内对照,最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 2.结果 2. 1 PcDNA3一tk的构建及鉴定 pBabe一tk质粒用BalnH工单酶切,回收约1 IOObp片段,将此片段与经BalnHI单酶切后去磷酸化的线性pcDNA3质粒连接,构建成重组质粒。转化感受态大肠杆菌J’M109,从LA培养板上挑8个菌落,经BamHI酶切鉴定后得到6个阳性菌落,酶切片段约为540Obp和1 IO0bp。omega基因分析软件进行基因序列分析发现tk编码区内存在两个EcoRV酶切位点,分别位于距5’端240bp和344bP处。在pcDNA3多克隆位点有一个EcoRV位点,位于BalnHI位点之后,用EcoRV酶切后,其重组正向阳性克隆酶切图谱应为约56O0bp、slobP和10Obp三个预期片段,反向图谱应为约6200bp、240bp和100bp三个预期片段。经EeoRV酶切鉴定郑州大学2004届硕士学位论文HSV-tk基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞株中的表达可得到2个阳性正向重组克隆,测序结果与报道的tk基因序列比较,完全一致,进一步证明目的基因己成功克隆入真核表达载体。 2.2转基因食管癌细胞株的建立 转染后细胞培养48小时,转至25ml的培养瓶,用含10%小牛血清的培养基培养,加G418筛选,3周后未转染细胞全部死亡,而转染细胞获得抗G418阳性克隆,分别取转染 PcDNA3一tk和pcDNA3的细胞提取总RNA,经AMV逆转录酶作用,反转录为cDNA。设计tk基因的两端引物,以反转录的cDNA为模板,并用份肌动蛋白作内对照,进行PCR反应。结果显示,转入重组载体pcDNA3一tk的食管癌细胞中出现两条特异性片段,大致约为1 IO0bp和200bp,而转入空载体pcDNA3的食管癌细胞仅见一条200bp片段。上述结果可见,pcDNA3一tk转染的细胞克隆中均有HSV一tk和B一肌动蛋白的特异性扩增片段,PcDNA3转染的细胞中仅出现B一肌动蛋白扩增片段,证明重组载体pcDNA3一tk已成功地转染入食管癌细胞?