在酿酒酵母中编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶基因有有五个基因ADH1-ADH5,其中乙醇脱氢酶Adhlp、Adh3p、Adh4p和Adh5p在糖酵解过程中还原乙醛生产乙醇,而Adh2p则催化乙醇氧化为乙醛,当外界环境中的葡萄糖消耗殆尽后,Adh2p主要负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应。因此,阻断Adh2p催化的乙醇分解代谢支路极有可能提高酿酒酵母发酵产乙醇的能力。本研究利用反义RNA技术,设计针对酿酒酵母ADH2基因5’UTR的反义RNA,通过重叠延伸PCR融合乙醇脱氢酶ADH25’UTR的反义RNA和KanMX抗性基因,通过Kpn I和Not I酶切与质粒pYES2.0连接,构建了酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体pSADH2。Kpn I内切酶线性化pSADH2后转化酿酒酵母Y01菌株。根据G418抗性筛选获得突变株S01。突变株S01经168h厌氧发酵后乙醇产量(V/V)为2.6%;同时对发酵液残糖检测表明,突变株S01糖代谢在一定程度上受到抑制。分别提取Y01和S01总RNA并进行实时荧光半定量PCR检测,结果表明酿酒酵母工程菌Y01乙醇脱氢酶ADH2基因mRNA5’UTR的反义RNA明显抑制酿酒酵母工程菌Y01乙醇脱氢酶ADH1和ADH2两基因的转录水平。结果表明通过反义RNA技术可以达到沉默基因的效果,为酿酒酵母工程菌改造提供依据。