免疫治疗是目前临床癌症治疗的新手段,探究新的癌症免疫治疗方法是近年研究热点之一。癌症免疫治疗的靶细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer,NK）细胞、巨噬细胞、B细胞等。其中基于T细胞的免疫疗法,如利用癌症疫苗（cancer vaccine）、免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T）等已取得相当大的进展。其中,癌症疫苗具有高选择性、低副作用、潜在的根治性等优点,目前已有多个癌症疫苗进入临床或临床试验阶段。癌症疫苗可利用肿瘤相关抗原激活、恢复或增强机体抗癌免疫应答,对癌细胞产生的特异性杀伤和清除。癌症疫苗治疗以细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）为最终效应细胞,CTL可特异性识别癌细胞表面由主要组织相容性复合物Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ,MHC Ⅰ）递呈的肿瘤相关抗原,通过产生颗粒酶、穿孔素等直接杀死癌细胞。目前,已经上市的癌症疫苗如Provenge（Sipuleucel-T）虽已取得了很好的治疗效果,然而其应答率及治疗效果仍未达到预期。影响癌症疫苗临床应用的主要原因是CTL介导抗癌免疫应答不足:癌症疫苗作为外源抗原被专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell,APC）摄取后主要被组织相容性复合物Ⅱ（major histocompatibility complex,MHCⅡ）递呈给CD4+T细胞,而被MHC Ⅰ分子递呈给CD8+T细胞进一步分化为CTL的概率较低。因此,目前癌症疫苗研究需要解决的一个重要问题就是如何增加抗原与MHCⅠ结合被递呈给CD8+T细胞,促使CD8+T细胞分化为CTL,从而增加癌症疫苗的免疫治疗效果。由于癌细胞可通过MHC Ⅰ的突变或缺失等免疫逃逸机制逃避CTL的免疫监视与杀伤,是影响癌症疫苗治疗效果的另外一个重要因素。NK细胞是除T细胞以外,机体杀伤癌细胞的主要免疫效应细胞,在癌症免疫中亦发挥着重要作用。NK细胞通过细胞毒作用（释放穿孔素和颗粒酶B,诱导Fas/FasL等凋亡途径）和分泌IFN-γ等发挥癌细胞直接杀伤作用和免疫调节功能。NK细胞不需要MHCⅠ存在即可发挥作用,可对表面MHCⅠ缺失的癌细胞产生有效杀伤,有效解决T细胞免疫治疗中因MHC Ⅰ缺失引起的免疫逃逸问题。因此,T细胞与NK细胞起效机制具有互补性,若能同时激活T细胞和NK细胞有望抑制癌细胞基于MHCⅠ缺失的免疫逃逸,进一步提高癌症免疫治疗效果。综上,课题拟利用新制剂技术增加癌症疫苗CTL介导抗癌免疫应答,联用癌症疫苗与NK细胞活化因子,克服目前癌症疫苗治疗中存在的问题,提高癌症联合免疫治疗的效果。论文首先设计构建新型癌症疫苗,以提高抗原MHC Ⅰ递呈率,增强癌症疫苗治疗效果。癌症疫苗接种后APC摄取并递呈,若采取措施将疫苗递送至APC细胞质中,疫苗抗原可与MHC Ⅰ结合并被递呈给CD8+T细胞,促使CD8+T细胞分化为CTL,从而发挥抗肿瘤效果,该过程称为交叉递呈（cross-presentation）。因此,增加抗原在APC的胞质递送和交叉递呈,是目前被认可的增强CTL介导免疫应答的有效途径之一。基于此,论文首次提出“级联胞质递送”策略,利用具有多重级联溶酶体响应能力的pH/redox双敏感胶束递送癌症疫苗,加速抗原的溶酶体逃逸速度,加速抗原的胞质递送,以增强抗原交叉递呈,提高CD8+T细胞介导的抗癌免疫应答,从而增强癌症免疫治疗效果。论文以OVA为模型抗原,制备载 OVA 的 pH/redox 双敏感胶束（OVA loaded micelle through disulfide bond,OLM-D）,考察OVA的级联胞质递送过程,通过抗原递呈实验、BMDC成熟实验、测定OLM-D免疫后小鼠脾脏淋巴细胞分型及免疫因子分泌量,证实“级联胞质递送”策略可提高抗原MHC Ⅰ分子结合率、抗原交叉递呈率和抗癌免疫应答。酪氨酸酶相关蛋白-2（Tyrosinaserelated protein-2,Trp2）是一种黑色素瘤相关抗原表位肽,在人和小鼠的黑色素瘤细胞均能被递呈,是理想的用于黑色素瘤免疫治疗的抗原之一。论文制备载Trp2的pH/redox双敏感胶束以验证“级联胞质递送”策略具有增强癌症疫苗治疗的效果。将免疫佐剂与肿瘤相关抗原联用,是提高癌症疫苗免疫应答的有效途径之一。免疫佐剂（immune adjuvants）是一类能非特异性增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。CpG是TLR 9受体的激动剂,是含非甲基化CpG基序的寡核苷酸,通过激活树突状细胞（dendritic cell,DC）细胞和巨噬细胞的TLR9受体后,产生Th1细胞相关的细胞因子并促进巨噬细胞极化,最终促进CD8+T细胞分化为CTL,是一类新型的免疫佐剂或免疫治疗剂。论文选择CpG为免疫佐剂,制备了 Trp2/CPG共载的pH/redox 双敏感胶束（Trp2/CpG co-loaded micelle,TCCM）。鉴于胶束粒径影响癌症疫苗的淋巴结聚集和APC摄取能力,课题分别制备70 nm和150 nm左右的TCCM,通过淋巴结分布和细胞摄取实验筛选更佳的疫苗粒径;验证了“级联胞质递送”策略可提高Trp2抗原的交叉递呈;对TCCM共递送Trp2和CpG的能力进行评价,验证了 CpG作为佐剂能够增强Trp2刺激BMDC的成熟;论文还考察了 CpG对肿瘤相关巨噬细胞极化的能力;证明CPG作为新型免疫疫苗佐剂可增强癌症疫苗治疗的效果。为阻断癌细胞基于MHC Ⅰ缺失的免疫逃逸,进一步增强癌症疫苗的治疗效果,论文初步探索了癌症疫苗联合NK细胞活化剂,进行联合免疫治疗的可行性。IL-15可激活NK细胞,增强NK细胞的杀伤功能,促进NK细胞分泌细胞因子等。本课题选择IL-15作为NK细胞活化因子,制备载IL-15的pH/redox双敏感胶束（IL-15 loaded pH/redox dual sensitive micelle,ILM）。将 ILM 与 TCCM 联用,二者粒径电位相似,给药后可同步分布到淋巴结;TCCM发挥癌症疫苗作用,ILM激活NK细胞,以期通过联合免疫治疗,增强抗癌免疫应答。通过体内外实验验证TCCM与ILM能分别促进DC成熟、激活NK细胞杀伤;通过体内抑瘤及免疫实验结果证明两者联用能同时增强CTL和NK细胞介导的抗癌免疫应答,发挥协同抑瘤效果,是一种可行的癌症联合免疫治疗手段。本课题的主要研究内容和结果如下:第一章基于“级联胞质递送”策略的pH/redox双敏感胶束作为新型癌症疫苗载体提高癌症免疫治疗效果的研究一、载OVA多重级联胶束的制备及表征:设计合成了多功能两嵌段材料PLH-PEG-NH2和聚组氨酸-聚乙二醇-3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀酰亚胺酯（poly（L-histidine）-poly（ethylene glycol）-N-Succinimidyl 3-（2-pyridyldithio）propionate,PLH-PEG-SPDP）;利用 1H-NMR验证了两种材料的合成;PLH-PEG-SPDP具有低的临界胶束浓度,具备自组装形成聚合物胶束的能力;其pKb值为pH 6.2,在溶酶体酸性环境中（pH 6.0）,PLH侧链咪唑环质子化由疏水变为亲水,可导致PLH-PEG-SPDP胶束解聚,具有pH敏感性。通过二硫键将模型抗原OVA连接到PLH-PEG-SPDP胶束表面,得到pH/redox双敏感胶束（OVA loaded micelle through disulfide bond,OLM-D）。同时制备通过酰胺键连接 OVA的 pH 敏感胶束（OVA loaded micelle through amido bond,OLM-A）作为对照。制备的OLM-D与OLM-A具有相近的粒径电位分布。二、OLM-D的级联胞质递送能力评价:以OLM-A为对照,验证了 OLM-D的抗原级联胞质递送过程:①验证了 OLM-D中OVA在溶酶体高GSH（10mM）环境中能实现氧化还原敏感释放;②证实了 OLM-D在溶酶体环境条件下（pH 6.0 PBS+10 mM GSH）可加速胶束解聚;③OLM-D的解聚能进一步加速OVA溶酶体逃逸。通过体外小鼠骨髓来源的树突状细胞（Dendritic cells derived from mouse bone marrow,BMDC）抗原交叉呈递实验对OLM-D与OLM-A的交叉递呈率进行评价,结果表明与OLM-A相比,OLM-D抗原交叉递呈率增加（p<0.05）,且OLM-D促进BMDC成熟的能力优于OLM-A（p<0.05）。利用小动物离体NIFR成像对OLM-D的淋巴结（lymph nodes,LNs）聚集能力进行考察,结果表明,与游离DiR相比,载DIR OLM-D的LNs蓄积能力增加,说明OLM-D具有较好的LNs滞留能力。通过测定OLM-D免疫后小鼠淋巴细胞分型及CTL相关细胞因子,结果表明OLM-D能促进细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌（p<0.05）,且OLM-D组小鼠脾脏CD3+CD8+T细胞和OVA特异性CD3+CD8+T细胞的比例与游离OVA相比增强（p<0.05）,表明OLM-D具有更好的介导免疫应答的能力。小鼠体重变化结果和心、肝、脾、肺、肾的H&E染色结果初步验证了 OLM-D的安全性。以上结果表明具有级联胞质递送能力的OLM-D疫苗具备加速溶酶体逃逸,增强抗原交叉递呈的能力,“级联胞质递送”策略能提高癌症疫苗免疫治疗效果。第二章多重级联Trp2/CpG共载pH/redox双敏感胶束作为新型癌症疫苗的研究一、Trp2/CpG共载多重级联胶束的制备及粒径筛选:分别制备了粒径为152.5±13.37 nm 的大粒径 Trp2/CpG 共载 pH/redox 双敏感胶束（Large Trp2/CpG coloaded pH/redox dual sensitive micelles,L-TCCM）和粒径为 68.02±2.32 nm 的小粒径 Trp2/CpG 共载 pH/redox 双敏感胶束（Small Trp2/CpG coloaded pH/redox dual sensitive micelles,S-TCCM）。L-TCCM 和 S-TCCM 的电位分别为-2.87± 1.12 mV和-3.65±0.80 mV。通过比较L-TCCM和S-TCCM的LNs蓄积能力及其被DC细胞摄取能力,表明S-TCCM 比 L-TCCM更容易被DC2.4细胞摄取且LNs蓄积能力更强,因此选择S-TCCM用于后续实验。二、Trp2/CpG共载多重级联胶束疫苗的免疫治疗效果考察:验证了 Trp2/CpG共载多重级联胶束具有“级联胞质递送”的能力;体外DC细胞摄取实验结果表明S-TCCM与混合胶束组（单载Trp2胶束和单载CpG胶束的物理混合物）比较,具有更好的同一 DC细胞共递送能力。体内淋巴结聚集实验结果表明,S-TCCM与混合胶束组比较,可有效实现Trp2和CpG的淋巴结共定位。S-TCCM的淋巴结共定位和和细胞共递送能力,有利于CpG发挥疫苗佐剂作用。溶酶体逃逸实验结果证明S-TCCM具备多重级联溶酶体快速逃逸能力;体外刺激BMDC成熟实验结果表明,与游离Trp2和游离CpG相比,S-TCCM刺激BMDC的CD80/CD86表达水平增加（p<0.05）;与小粒径单载Trp2的pH敏感胶束（Small Trp2 loaded micelle,S-TLM）比较,S-TCCM 刺激后 BMDC 表明 CD86 表达水平增加（p<0.05）,说明S-TCCM与S-TLM相比具有更好的刺激BMDC成熟能力;利用肿瘤相关巨噬细胞极化实验考察S-TCCM调节肿瘤相关巨噬细胞极化的能力,结果表明CpG（1.5 μg/mL）具有刺激M2型RAW264.7向M1型RAW264.7极化的能力,且S-TCCM促肿瘤相关巨噬细胞极化能力优于游离CpG和S-TLM（p<0.05）。上述结果说明,S-TCCM能实现Trp2和CpG的共递送,且CpG作为佐剂能够增强S-TLM刺激BMDC成熟的能力;S-TCCM还具有促进肿瘤相关巨噬细胞极化的能力,可进一步增强疫苗的免疫治疗效果。上述实验结果证实,具有多重级联能力的Trp2/CpG共载S-TCCM是一种理想的新型癌症疫苗。第三章多重级联pH/redox双敏感胶束共递送Trp2/CpG疫苗与IL-15用于癌症联合免疫治疗的研究制备载 IL-15 的 pH/redox 双敏感胶束（IL-15 loaded pH/redox dual sensitive micelles,ILM）。ILM 的粒径为 69.67±7.08 nm,电位为 1.40±0.35 mV,形态圆整,分散均匀,IL-15的连接率为89.1%±0.09%。提取小鼠脾脏及外周血中的NK细胞,其CD3-CD49+阳性率为96.1%,通过MTT法测得在不同的效靶比（2.5:1、5:1、10:1、20:1）下,被 IL-2、IL-15 及 ILM 激活的 NK 细胞对 B16-F10 的杀伤性能相当。以荷B16-F10黑色素瘤小鼠为模型进行体内抑瘤实验,结果表明与游离 Trp2、游离（Trp2+CpG）、空白胶束（blank micelle,BM）、S-TLM 组相比,S-TCCM具有较好的抑瘤效果（p<0.05）;与S-TCCM和游离IL-15+S-TCCM相比,ILM+S-TCCM的抑瘤效果更好（p<0.01）。对荷瘤小鼠给药后肿瘤组织中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、IFN-γ+CD3+CD8+T、CD3-CD49+NK 细胞的分型及血清中IFN-γ的分泌量进行定量研究,S-TCCM与游离Trp2、游离（Trp2+CpG）相比,可增加 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、IFN-γ+CD3+CD8+T 数量和 IFN-γ 分泌量（p<0.05）。游离 IL-15+S-TCCM、ILM+S-TCCM 与 S-TCCM 相比,CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、IFN-γ+CD3+CD8+T 数量无明显差异（p>0.05）,CD3-CD49+NK及IFN-γ分泌量增加（p<0.05）。该结果说明,S-TCCM是一种理想的新型癌症疫苗,ILM与S-TCCM联合使用通过活化NK细胞增加了癌症疫苗的治疗效果。小鼠体重变化、血常规分析和小鼠主要器官（心、肝、脾、肺和肾）H&E染色结果初步表明ILM+S-TCCM具有良好安全性。上述结果初步显示多重级联pH/redox双敏感胶束共递送Trp2/CpG疫苗与IL-15,是一种有前景的癌症联合免疫治疗新手段。