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食管癌(esophageal cancer,EC)是世界范围第八大最为常见的恶性肿瘤,每年估计有450,000新发生的病例和400,000死亡的病例。EC具有两种主要的组织学类型,即鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,AC),其主要的差别在于发病机制、流行病学、肿瘤生物学、预后及治疗手段的不同。目前,针对食管癌病人常常采用多种不同模式的治疗手段,即食管切除术联合手术期间的化疗或辅助的放化疗已经证实能改善病人的预后,因而成为EC病人标准的治疗手段。然而,由于肿瘤侵袭的特性及缺乏有效的个体治疗方法,EC病人的预后仍然很差,其5年生存率仅保持在36%-47%。因此发展EC新的治疗手段和寻找新的分子靶点对于改善EC病人的预后具有十分重要的价值。人前梯度基因2(Anterior gradient 2,AGR2)是爪蟾粘腺蛋白XAG-2的一种同源类似物。AGR2基因主要定位于人染色体7p21.3区域,由8个外显子和9个转录本构成,属于蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族成员之一,定位于内质网(endoplasmic reticulum,ER)中。目前,AGR2的过表达已经在多种不同的肿瘤中被报道,它能促进肿瘤的进展和恶性转化。最为重要的是,AGR2作为潜在的有希望的诊断标志也已经被证实,并可能成为肿瘤新的预后因子。这些研究充分表明,AGR2可能在多种不同的肿瘤的发生、发展、进展和转移中发挥重要的作用,因而可能成为许多肿瘤潜在的分子治疗靶点和预后因子。然而,AGR2在食管鳞癌发生发展中的作用尚不清楚,为了进一步探讨AGR2在食管鳞癌发生发展中的作用,本研究首先采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western blot分析食管鳞癌组织和细胞中AGR2 mRNA和蛋白的表达,分析其表达与食管鳞癌病人临床病理学参数和预后之间的关系。进一步将AGR2siRNA和siRNA对照转染食管鳞癌EC1细胞,研究其表达下调对食管鳞癌细胞增殖、细胞周期和侵袭的影响,该研究旨在为以AGR2为靶点的食管鳞癌的基因治疗提供理论依据。方法(1)采用免疫组织化学技术检测97例食管鳞癌组织和对应的正常食管上皮组织中AGR2蛋白的表达。(2)利用SPSS17.0软件分析AGR2蛋白的表达与食管鳞癌病人临床病理学参数及预后之间的关系。(3)采用实时荧光定量PCR技术检测随机选择的8例食管鳞癌组织和对应的正常食管上皮组织中AGR2 mRNA的表达。(4)采用实时荧光定量PCR和Western blot检测不同食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞中AGR2 mRNA和蛋白的表达。(5)利用脂质体2000,将AGR2 siRNA和siRNA对照分别转染食管鳞癌EC1细胞,并将细胞分为三组:未处理组、siRNA对照组和AGR2 siRNA组。(6)利用CCK-8试剂检测不同处理组别的食管鳞癌EC1细胞增殖能力的变化。(7)利用流式细胞术检测不同处理组别的食管鳞癌EC1细胞周期分布的变化。(8)利用Transwell小室检测不同处理组别的食管鳞癌EC1细胞侵袭能力的变化。(9)统计学处理:上述所有实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析。免疫组织化学的结果采用卡方检验,AGR2蛋白表达与食管鳞癌病人预后之间的关系采用Log-rank(Mantel-Cox)检验进行分析。对于两组之间的比较采用t检验,对于3组及以上的比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)。检验水准α=0.05。结果(1)AGR2在食管鳞癌组织中的表达阳性率(82/97,84.5%)显著高于对应的正常食管上皮组织(11/97,11.3%),且差异具有统计学意义(c2=104.115,P<0.05)。(2)随机选择的8例食管鳞癌组织中AGR2 mRNA的相对表达水平均显著高于其对应的8例正常食管上皮组织,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)AGR2蛋白表达与食管鳞癌病人的性别和年龄均无关(均P>0.05),但与组织学分化、临床分期以及淋巴结的转移均密切相关(所有P<0.05)。(4)Log-rank(Mantel-Cox)检验的结果表明,AGR2的表达与食管鳞癌病人的预后之间存在明显的相关性,AGR2高表达的食管鳞癌病人的存活时间显著低于AGR2低表达的食管鳞癌病人,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)3株食管鳞癌细胞株(EC1、Eca109和EC9706)中AGR2 mRNA和蛋白的相对表达水平均显著高于正常食管上皮细胞Het-1A,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。最为重要的是,食管鳞癌EC1细胞中AGR2 mRNA和蛋白的相对表达水平均显著高于其它所研究的细胞,且差异也具有统计学意义(P<0.05)。(6)与未处理组和siRNA对照组相比,AGR2 siRNA组中AGR2蛋白的相对表达水平显著下调,且差异也具有统计学意义(P<0.05)。(7)与未处理组和siRNA对照组相比,AGR2 siRNA组中食管鳞癌EC1细胞的增殖能力显著被抑制,且差异也具有统计学意义(P<0.05)。(8)AGR2 si RNA组中食管鳞癌EC1细胞在G0/G1期的细胞数的比率为64.77±1.12%,显著高于未处理的EC1细胞(52.48±1.26%)和siRNA对照转染的EC1细胞(52.29±1.24%),且差异具有统计学意义(F=105.850,P<0.05)。进一步分析表明,AGR2 siRNA组中食管鳞癌EC1细胞在S期的细胞数的比率为21.71±0.87%,显著低于未处理的EC1细胞(29.09±0.71%)和siRNA对照转染的EC1细胞(29.40±1.91%),且差异具有统计学意义(F=34.859,P<0.05)。此外,AGR2 siRNA组中食管鳞癌EC1细胞在G2/M期的细胞数的比率为13.52±1.89%,显著低于未处理的EC1细胞(18.43±1.63%)和siRNA对照转染的EC1细胞(18.31±1.11%),且差异具有统计学意义(F=9.437,P<0.05)。(9)AGR2 siRNA组中食管鳞癌EC1细胞的穿膜数为52.67±15.01,显著低于未处理的食管鳞癌EC1细胞(132.67±16.50)和siRNA对照转染的食管鳞癌EC1细胞(125.33±14.57),且差异具有统计学意义(F=24.791,P<0.05)。结论(1)AGR2在食管鳞癌的发生发展中发挥重要作用,可能发挥癌基因的作用,并可能成为食管鳞癌新的预后因子。(2)AGR2表达下调能介导食管鳞癌细胞增殖抑制、细胞周期分布改变和侵袭能力下降,因而抑制AGR2的表达可能成为食管鳞癌新的治疗策略。