论文部分内容阅读
目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制survivin基因的表达,观察重组质粒对K562细胞分化及化疗敏感性的影响并探讨其机制,为临床白血病治疗提供理论依据。方法:1.转染survivin重组质粒对K562细胞survivin mRNA和蛋白表达的影响。实验分三组:RNAi组、脂质体组、空白组。经阳离子脂质体介导的方式进行转染。转染48小时后RT-PCR检测survivin mRNA表达情况,免疫组织化学法检测survivin蛋白表达。2、重组质粒对K562细胞分化影响。实验分三组:RNAi组、脂质体组、空白组。转染48小时后用光学显微镜检查细胞的形态变化,RT-PCR方法检测c-myc、c-fos mRNA表达情况,免疫组织化学法检测c-myc、c-fos蛋白表达,流式细胞仪检测细胞表面分子CD13、CD33表达情况。3、阿霉素对K562细胞的抑制作用。实验分两组:RNAi组、空白组。用MTT法测定不同浓度的阿霉素对各组K562细胞的抑制率,根据其对K562细胞的抑制情况选择浓度为0.2ug/ul的阿霉素作用于各组细胞,1小时后流式细胞仪检测各组细胞内阿霉素的荧光强度。流式细胞仪检测各组细胞内阿霉素的荧光强度。4、K562细胞耐药机制研究。实验分三组:RNAi组、脂质体组、空白组。免疫组织化学法检测各组细胞p-gp、GST-π、TOPOII三种耐药蛋白的表达水平。结果:1、survivin mRNA和survivin蛋白在K562细胞中呈高表达,转染重组质粒后survivin表达下调(p<0.05),而脂质体组及空白组无明显变化。2、RNA干扰组K562细胞转染48小时后细胞形态学出现改变, CD33表达下降(P<0.05),CD13的表达较对照组无明显改变。3、转染48小时后RNA干扰组细胞c-myc mRNA及蛋白表达较两对照组降低(p<0.05),c-fos mRNA及蛋白与对照组相比表达无明显改变(P>0.05)。4、阿霉素对K562细胞的抑制作用呈浓度依赖性,浓度越大抑制作用越强。RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性较对照组增高(P<0.05),RNA干扰组细胞内阿霉素平均荧光强度为120.71,较两对照组明显增高(P<0.05)。5、RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达下降(P<0.05)。结论:1、重组质粒pshRNA-survivin可下调K562细胞survivin mRNA和蛋白表达;2、survivin基因与K562细胞的分化有关,但诱导其向粒系分化可能性小;3、RNA干扰survivin基因可增加K562细胞对阿霉素的敏感性;4、RNA干扰survivin基因可能通过降低耐药蛋白GST-π的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。