多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是育龄期女性最常见的内分泌疾病,是引起无排卵不孕和高雄激素血症的主要原因。PCOS是一种多基因相关疾病,表现为复杂的遗传方式,其基本特征为雄激素过多、卵巢功能异常、卵巢多囊样改变。临床病因、症状复杂,除了导致不孕不育,同时易伴发全身多系统疾病,如代谢综合征、糖耐量减低、2型糖尿病、高脂血症、高血压和心血管疾病等。近年来PCOS发病率呈上升趋势,鉴于目前病因学研究尚不明确,通过病因学研究识别PCOS高危人群,并对其进行早期预警和干预尤为重要。PCOS患者的发病与遗传和环境因子共同影响有关,寻找致病基因的相关分子机制一直是PCOS遗传学研究的重点。GWAS研究发现Dennd1a的单核苷酸多态性与PCOS相关,因此Dennd1a基因在生殖细胞发育中作用受到越来越多的关注。其中Dennd1a已被证实对卵巢雄激素的合成至关重要。通过本课题的研究,我们构建Dennd1a全敲小鼠模型,阐明了 Dennd1a基因对小鼠胚胎及生殖细胞发育的重要作用及分子机制。在第一章中,我们探讨了 Dennd1a基因对小鼠胚胎发育的作用。首先构建Dennd1a基因敲除小鼠,发现Dennd1a-/-胚胎发育过程中死亡,推断时间约在E14.5,同时大脑、肝脏、性腺等组织器官发育异常。进一步研究发现,Dennd1a的敲除引起各器官实质细胞的增殖、分化异常,尤其是肝脏造血细胞的减少,进而影响纯合突变小鼠的造血功能,最终导致Dennd1a-/-小鼠胚胎的死亡。并且,通过碱性磷酸酶染色,我们发现Dennd1a敲除小鼠的原始生殖细胞迁移、增殖、分化延迟。以上研究通过构建Dennd1a敲除模型小鼠,发现Denndla对小鼠胚胎各组织器官形态发生、功能发育以及生存具有重要的作用,为进一步研究Dennd1a在PCOS的机制研究提供了理论基础。在第二章中,我们探讨了 Dennd1a基因在小鼠生殖细胞发育中作用和机制。通过Dennd1a-/-小鼠验证了 Dennd1a基因的缺失影响了原始生殖细胞的分化和减数分裂的启动,同时在体外培养的状态下,用sh-Dennd1a腺病毒转染野生型小鼠性腺敲降Dennd1a,得到了相同的结果,进一步验证了 Dennd1a全敲小鼠对于生殖细胞发育的影响。通过研究Dennd1a在生殖嵴的定位及细胞分选,发现Dennd1a主要是在胚胎体细胞中发挥作用。通过体细胞体外培养,进行体细胞的敲降及加入其他干扰因子后,发现Dennd1a通过调控PI3K-AKT信号和经典WNT信号通路,影响体细胞中wnt5a和RA的合成,从而影响生殖细胞的分化和减数分裂的启动,同时sh-Dennd1a腺病毒转染的性腺加入wnt5a及RA后,Dennd1a敲降的生殖细胞的分化及减数分裂得到了一定程度的回复。本研究通过解析Dennd1a在胚胎发育及生殖细胞发育中的作用,验证了Dennd1a对于小鼠胚胎发育是必不可少的,进一步证明了 Dennd1a调控生殖细胞发育的相关分子机制,为揭示Dennd1a在PCOS的作用及发病机制提供了新的理论依据,对PCOS患者的疾病治疗及干预具有重要意义。第一章多囊卵巢综合征的易感基因,Dennd1a,在胚胎发育中的作用背景多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是一种复杂的育龄期妇女内分泌疾病,全球发病率为6-8%,该疾病的诊断包括慢性高雄激素血症,不排卵和/或多囊卵巢,以闭经,不孕,多毛,痤疮为主要临床表现,是最常见的内分泌疾病。一般认为,PCOS是由基因和环境因素共同影响的疾病。全基因组关联研究发现,多囊卵巢综合征的患者Dennd1a基因的单核苷酸多态性与PCOS之间存在关联,Dennd1a蛋白定位于卵巢卵泡膜细胞的细胞质和细胞核中,在PCOS的患者的卵泡膜细胞中,Dennd1a蛋白表达水平明显升高。此外,分离PCOS患者的膜间质细胞进行体外培养,敲除Dennd1a可降低PCOS膜间质细胞中雄激素的生物合成,表明Dennd1a在PCOS相关的高雄激素血症的发生中发挥作用。然而,我们对Dennd1a基因在小鼠胚胎发育及其生殖细胞中的作用知之甚少。目的探讨DENND1A在小鼠胚胎发育中的作用。方法构建Dennd1a基因敲除的小鼠品系,检测Dennd1a的敲除效率。确定Dennd1a的缺失导致胚胎致死并通过形态特征观察胚胎死亡的时间,再进行胚胎组织学切片,检测纯合子各器官组织学形态与对照组的区别。用免疫组化方法,PHH3标记增殖细胞,cleaved-caspase3标记凋亡细胞,检测Dennd1a缺失对大脑和肝脏的增殖和凋亡的影响,进一步用原位杂交的方法检测Dennd1a的缺失对其他信号通路的影响,例如用Hnf4α（早期肝细胞形成的影响因子）,sox9（影响胆管发育的转录因子）,pecaml（影响血管上皮细胞形成的关键因子）,CD45（造血细胞形成的影响因子）标记对照组及纯合子组小鼠胚胎的肝脏。此外,进一步检测了Dennd1a的缺失对原始性腺发育的影响,利用原始生殖细胞碱性磷酸酶（AP）高表达的特点,进行AP染色标记不同时期原始性腺的发育过程,并用实时定量PCR的方法检测sohlh2（调控生殖细胞分化的标记物）在E13.5Dennd1a+/+或Dennd1a+/-及Dennd1a-/-雌性性腺的表达情况并进行对照分析,进而探索Dennd1a基因缺失与性腺发育的相关性。此外,通过碱性磷酸酶染色以及实时定量PCR实验检测影响原始生殖细胞分化的因子Soh1h2的表达,确定Dennd1a的缺乏是否影响了原始生殖细胞的增殖和凋亡,通过上述实验揭示了 Dennd1a对小鼠胚胎发育至关重要,Dennd1a影响多个组织器官的发育,Dennd1a介导的内吞途径可能是参与调节多种胚胎器官系统的发育的关键。结果1.Dennd1a的纯合突变导致胚胎致死收集胚胎期9.5-14.5天的对照组和纯合子胚胎,对照两组之间的形态改变。研究发现相对于对照组,在E14.5 Dennd1a-A小鼠胚胎中脑室扩大、肝脏颜色变淡,大部分Dennd1a-/-胚胎没有心脏跳动,上述结果显示Dennd1a的缺失影响了包括大脑和肝脏在内的多个器官的发育,这些结果表明Dennd1a对于小鼠胚胎形成是必不可少的。原位杂交分析表明,Dennd1a mRNA在E9.5胚胎中广泛表达,在前脑,鳃弓和四肢肢芽表达明显。在E10.5时,Dennd1a在胚胎中的表达模式相似,但实时定量PCR结果显示在E10.5的Dennd1a的mRNA的表达量更高。我们的发现表明Dennd1a可能在多个胚胎器官的形态发生中发挥作用。2.Dennd1a的缺失会导致大脑发育缺陷在E11.5,E12.5小鼠胚胎组织学染色结果显示,相对于Dennd1a+/-胚胎,Dennd1a-/-胚胎的脑室变大、脑室壁变薄。检测PHH3在E11.5背侧端脑的阳性率,在Dennd1a+/-大脑中,大约45.4%的神经上皮细胞阳性着色,而在Dennd1a-/-大脑中,大约23.2%的阳性着色率。与此同时,在Dennd1a-/-胚胎的大脑中,活化的β-catenin的蛋白表达水平的降低,促进细胞周期的影响因子c-Myc和cyclinD1的表达减少,显示Dennd1a的缺失下调了影响小鼠大脑发育的Wnt经典信号通路。用Nestin和微管结合蛋白2（MAP2）检测E11.5脑前体细胞的神经元细胞的表达量的改变,western blot结果显示在Dennd1a-/-小鼠的大脑中,Nestin和MAP2的表达较低,表明Dennd1a纯合突变小鼠有较少的神经前体细胞和分化神经元。以上这些结果提示,细胞增殖和分化的异常可能导致胚胎Dennd1a-/-小鼠胚胎大脑的神经缺陷。接下来,用cleavaed-caspase 3抗体标记凋亡细胞,检测Dennd1a的缺失对神经上皮细胞存活的影响,在E11.5 Dennd1a+/-端脑中线检测到若干凋亡细胞,生理状态下凋亡细胞通常在该时期该区域大量存在,相比之下,在Dennd1a-/-胚胎的相同区域,凋亡细胞明显减少。而相较于对照组,E11.5、E12.5的外侧端脑检测到更多的凋亡细胞。这些结果表明,Dennd1a缺失可抑制胚胎大脑发育过程中通常发生在端脑内侧壁的细胞凋亡,而损害脑外侧神经外胚层细胞的存活。为进一步研究Dennd1a是否参与了胚胎脑模式的形成,我们检测Fgf8的表达,Fgf8属于成纤维细胞生长因子（FGF）,调控吻侧端脑和中脑、后脑的发育。E9.5野生型小鼠大脑中Fgf8 mRNA的表达在端脑吻侧中线和中脑/后脑边界,在Dennd1a-/-胚胎中的表达模式似乎相似,但表达域略有扩展。但E10和E10.5时,Dennd1a缺失导致端脑背侧中线Fgf8 mRNA异位表达。此外,定量实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示,在E11.5,与野生型对照相比,Dennd1a-/-胚胎的大脑Fgf8 mRNA的表达量显著升高。与之相对应,在E11.5 Dennd1a-/-胚胎的大脑中,控制背侧端脑发育的典型Wnt信号通路下游靶点Axin2的表达减少。我们还检测了 Nkx2.1和Lhx2的表达,Nkx2.1是调控丘脑和下丘脑发育所需的同源框基因,Lhx2是调控大脑皮层和眼睛发育所必需的转录因子。原位杂交结果显示,Nkx2.1在E9.5胚胎腹侧端脑和间脑表达,Lhx2的表达位于E10.5胚胎前脑和视杯。Dennd1a-/-胚胎显示Nkx2.1和Lhx2的表达模式与Dennd1a+/-胚胎的表达模型相同。这些发现表明Dennd1a可能不参与早期胚胎大脑初始模式的形成,但很可能参与了进一步大脑形态发生。3.Dennd1a的缺失损害肝脏的发育除神经缺陷外,Dennd1a-/-胚胎也显示肝脏发育异常。在E12.5和E14.5,与对照组比较,Dennd1a-/-胚胎肝脏的大小显著减少。在胚胎期间,肝脏从前肠内胚层形成,细胞增殖并迁移到周围的隔膜。为确定肝细胞增殖和存活率是否受到Dennd1a缺陷的影响,用免疫组化法检测E12.5胚胎横断面pHH3和Cleaved-Caspase 3免疫染色。结果显示 Dennd1a-/-和 Dennd1a+/-分裂细胞占比约为 8.9±1.0%vs 12.6±1.4%;P＜0.05,表明Dennd1a的破坏导致肝细胞增殖减少。另一方面,Dennd1a缺乏并没有影响细胞凋亡。在肝脏中,Cleaved-Caspase 3阳性细胞在E12.5 Dennd1a-/-或者Dennd1 a+/-胚胎的肝脏中检测到仅有少量表达。上述结果说明在小鼠胚胎肝脏形成的过程中,Dennd1a调控肝脏细胞的增殖,但是对肝脏细胞存活不是必须的。在肝脏生成时,肝脏内胚层分化为肝细胞或胆管细胞。肝细胞是肝脏主要的实质细胞类型。肝细胞表达转录因子Hnf4α是调控早期肝细胞命运的指标。免疫组织化学分析显示,在E12.5 Dennd1a-/-或对照组胚胎肝脏中肝细胞表达了Hnf4α。实时定量PCR进一步揭示,Hnf4α的mRNA的表达水平在E12.5Dennd1a-/-的肝脏中明显下降。表明Dennd1a的缺失影响了肝细胞的分化。接下来检查Dennd1a缺失对胆管细胞分化的影响。胆管细胞分化最早开始表达因子Sox9,Sox9是控制胆管细胞发育的转录因子。sox9+细胞局限在肝内胆管周围发现。然而,在Dennd1a-/-胚胎肝脏中,Sox9的表达分散,不局限在胆管周围的区域,并伴有Sox9转录水平的升高。这个结果表明Dennd1a缺乏可以促进肝原细胞向肝内胆管细胞的分化。到E11,大多数胚胎的肝脏表达CD45（一个泛表达造血因子）,从E12到出生,胚胎肝脏是造血的主要器官,内皮细胞中表达pecam1,被称为血管内皮细胞标记物。实时定量PCR结果显示CD45的mRNA水平在E12.5 Dennd1a-/-胚胎的肝脏中减少,而pecam1表达增加,表明Dennd1a的缺乏也会影响肝脏造血和血管的形成,这可能导致肝脏大小的改变和胚胎的造血功能损伤,最终导致Dennd1a-/-小鼠胚胎的死亡。4.Dennd1a的突变影响了原始生殖细胞的发育在小鼠中,原始生殖细胞（PGCs）在胚外中胚层的后羊膜褶中出现,以高碱性磷酸酶（AP）活动为特征。在E8.5和E13.5之间,原始生殖细胞通过后肠内胚层和肠系膜向生殖嵴增殖和迁移。在E9左右,原始生殖细胞在野生型胚胎通过后肠内胚层和肠系膜迁移,大多数的原始生殖细胞已经迁移到第八对体节近尾芽处。与此相反,原始生殖细胞在Dennd1a-/-胚胎迁移明显发生了延迟,其中很少有原始生殖细胞到达相应的躯体边界。在E10.5,野生型胚胎的原始生殖细胞到达性腺原基,在E11.5,原始生殖细胞在性腺继续增殖,然而,在相应的时期,Dennd1a-/-小鼠胚胎中原始生殖细胞较少出现在性腺原基,之后,性腺原基变厚并通过性别基因的调控决定生殖细胞向睾丸或者卵巢的形成,在雌性小鼠中,调控精子和卵子发生转录因子（Sohlh2）表达在约E13.5调节卵母细胞的分化。根据AP染色,E13.5雌性Dennd1a-/-小鼠性腺与对照组相比稍长、稍窄。实时定量PCR结果显示,Denndla的缺乏使Sohlh2在胚胎卵巢中表达显著降低。这些结果表明,缺乏Dennd1a可能会干扰原始生殖细胞的增殖、迁移和分化。结论上述结果揭示了 Dennd1a对小鼠胚胎发育至关重要,表明Dennd1a介导的核内体的内吞和再循环途径可能参与调节多种胚胎器官系统的发育。本研究首次发现Dennd1a的缺失导致胚胎期小鼠在约E14.5死亡,并阐明突变分别影响大脑、肝脏,原始性腺的发育,阻碍了相应组织器官细胞的增殖、分化和凋亡,进一步证实了Dennd1a基因对小鼠胚胎发育是必不可少的;同时发现Dennd1a基因的缺失影响了原始生殖细胞的增殖,分化和迁移,然而,Dennd1a在原始生殖细胞发育的作用有待于进一步探究。第二章Dennd1a调控雌性胚胎期生殖细胞发育的机制研究背景Dennd1a,GTPase Rab35鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）对小鼠胚胎发育至关重要。研究发现Dennd1a的缺失破坏了胚胎期生殖细胞的迁移和分化,但导致胚胎生殖细胞发育异常的途径尚不清楚。在本研究中,我们进一步阐明了Dennd1a在胚胎期卵巢中生殖细胞分化和减数分裂的作用,Dennd1a通过调节PI3K/AKT和WNT信号通路来影响体细胞中Wnt5a和视黄酸的表达,从而影响生殖细胞的形成和减数分裂的启动。Denndla主要在胚胎期卵巢的体细胞中表达。在E13.5的Dennd1a-/-小鼠胚胎的卵巢中,Dennd1a的敲除破坏了卵原细胞中Sohlh2、Figla、Stra8以及Rec8的mRNA表达。在E12.5雌性性腺体外培养和Dennd1a shRNA腺病毒感染性腺的体外培养实验中,我们证明了影响生殖细胞分化和减数分裂启动的影响因子Sohlh2、Figla、Stra8和Rec8在Dennd1aKD卵巢中mRNA表达量降低,卵母细胞的启动和减数分裂的启动受到了抑制,因此,Dennd1a是卵母细胞分化和减数分裂启动的必要条件。除此之外,Dennd1a可以通过调节Wnt5a合成,在卵细胞分化早期刺激Sohlh2表达。胚胎期生殖细胞的减数分裂的启动也需要体细胞中视黄酸的合成,调控生殖细胞减数分裂启动的相关因子Stra8和Rec8的合成。同时研究发现在体细胞中Dennd1a通过调控体细胞中PI3K-AKT和wnt通路控制胚胎期卵母细胞分化和减数分裂的启动。最后,通过在性腺的体外培养试验中加入wnt5a和/或视黄酸,比较对照组和Dennd1a KD卵巢中调控生殖细胞的分化和减数分裂启动相关影响因子。研究结果显示Dennd1a可能通过调控体细胞中的多个信号通路影响相关影响细胞因子的合成,对卵母细胞分化和减数分裂发育分化的不同过程和阶段至关重要。目的本研究旨在通过开展胚胎期卵巢的研究,发现Dennd1a对生殖细胞的分化和减数分裂影响,探讨Dennd1a介导的相关分子机制对胚胎期生殖细胞影响,为发现Denndla异常导致PCOS的发生提供理论依据。方法通过实时定量PCR检测在Dennd1a敲除小鼠模型中,检测E13.5 Dennd1a-/-突变体卵巢中Sohlh2,Figla,Stra8和Rec8的mRNA的表达。通过体外培养E12.5雌性生殖腺和转染shRNA-Dennd1a腺病毒,进一步验证Sohlh2、Figla、Stra8和Rec8的表达。Dennd1a在体细胞中是卵母细胞分化和减数分裂起始所必需的。用Denndla shRNA的腺病毒感染性腺,在转录和翻译水平检测实验组和对照组体细胞中合成Wnt5a和RA的相关因子表达量改变,检测Dennd1a的改变对卵母细胞分化和减数分裂的影响。结果1。Dennd1a在胚胎卵巢中表达量逐渐增加,在体细胞中表达量高于生殖细胞E11.5小鼠胚胎,Dennd1a的表达位于后肠肠系膜和生殖嵴上,提示Dennd1a可能在PGCs通过肠系膜向生殖道嵴迁移中发挥作用。在胚胎期卵巢中,Dennd1amRNA的表达水平在卵细胞分化和减数分裂的早期阶段（E12.5、E13.5和E15.5）逐渐增加,。而在出生后1周、3周或6周的卵巢中,Dennd1amRNA和蛋白质的表达没有明显改变。使特定的胚胎抗原（SSEA1）作为胚胎生殖细胞标志物,免疫荧光结果表明Dennd1a主要在E11.5和E13.5的体细胞中表达,与原始生殖细胞表达位点几乎不重合。在E14.5和E17.5胚胎期卵巢中,使用Stella和DDX4作为生殖细胞标记物,通过流式细胞分选法分离E11.5和E13.5雌性性腺中的生殖细胞和体细胞。结果显示在体细胞中,Dennd1a的mRNA表达量比胚胎期生殖细胞中高。上述结果表明,Dennd1a主要在胚胎卵巢的体细胞中表达,而在体细胞中,Dennd1a介导的内吞作用可能涉及相关细胞因子的调控,这对胚胎期生殖细胞的发育至关重要。2.Dennd1a的缺失影响了胚胎卵巢中卵子发生和减数分裂的启动为了评估胚胎发育过程中卵母细胞的分化和减数分裂的启动,我们检测了胚胎卵巢中Sohlh2、Figla、Stra8和Rec8 mRNA的表达。Sohlh2作为生殖细胞或卵母细胞的转录因子,在E13.5时mRNA水平升高,在E15.5时表达水平下降,而Figla在E13.5时被激活,在E15.5时显著升高。卵母细胞减数分裂所必需的两个基因Stra8和Rec8的转录均在E13.5左右被激活。然而,通过敲除Dennd1a基因的小鼠,我们发现在E13.5 Dennd1a-/-突变体的卵巢中,这些基因的mRNA表达量明显降低。Dennd1a的缺失不仅影响了 Sohlh2的转录,也影响了 Figla、Stra8和Rec8在这个发育阶段的转录。由于Dennd1a-/-突变体在E14.5左右死亡,雌性纯合子胚胎生殖嵴的获取相对困难,不利于为进一步确定Dennd1a缺失是否能够调控相关信号通路从而影响卵母细胞分化和减数分裂起始相关基因的表达。因此,我们通过培养E12.5野生型雌性胚胎的生殖嵴,建立了体外性腺培养体系。体外野生型性腺中Sohlh2、Figla、Stra8和Rec8的mRNA表达在孵育48 h后被激活,其表达模式与E13.5时性腺相似。用带GFP荧光标记的腺病毒shRNA-Dennd1a转染E12.5性腺,敲减Dennd1a的表达量。感染48 h或更长的时间后,Dennd1a mRNA和蛋白的表达量下降到野生型表达的一半左右,而在腺病毒转染72 h的性腺的样本中Sohlh2、Figla、Stra8和Rec8的mRNA表达未被激活。3.Dennd1a通过调控PI3K-Akt和经典wnt/β-catenin信号通路介导体细胞中Wnt5a和RA的合成外源性的wnt5a促进胚胎期卵母细胞sohlh2的表达升高,而对FIGLA、STRA8和REC8表达无明显影响。胚胎期生殖细胞需要RA诱导减数分裂的启动,外源性的RA可以促使与减数分裂相关基因Stra8和Rec8的表达增高。用sh-Dennd1a感染胚胎期性腺,取培养上清检测视黄酸的浓度,结果表明相较于对照组,Dennd1a敲减后体细胞培养上清视黄酸的浓度降低,western blot结果显示wnt5a的表达水平降低。外源性Wnt5a（350ng/mL）可刺激Dennd1a敲除胚胎期卵巢中Sohlh2的表达,达到与野生型对照相当的水平。然而,外源Wnt5a不能挽救Dennd1a敲降胚胎期卵巢中Figla、Stra8或Rec8 mRNA表达的下降（图4B）。另一方面,外源性的视黄酸（1uM）激活了野生型和腺病毒Dennd1a shRNA感染胚胎期卵巢中Stra8和Rec8的表达,但对Sohlh2和Figla的表达没有影响。以上结果提示,Dennd1a可能参与调控胚胎卵巢体细胞产生Wnt5a和RA,这两种物质分别是卵母细胞分化和减数分裂起始所必需的。我们进一步研究了 Dennd1a在体细胞中的信号靶点及其控制胚胎卵母细胞分化和减数分裂的机制。腺病毒处理性腺72小时后,Dennd1a基因的下调导致非磷酸化的β-catenin,以及β-catenin依赖转录的下游靶点蛋白Axin2的激活减少。这可能是由于p-Akt水平的降低和p-GSK3β表达水平的升高。下调的β-catenin信号通路可能是通过降低Stat3的表达和磷酸化水平的表达以及降低Aldh1a1的表达,改变胚胎期卵巢中Wnt5a和RA合成,是影响合成的上游调控因子。外源Wnt3a（100ng/mL）处理可以刺激体细胞中wnt5a和RA的表达。然而,外源LY294002（PI3K抑制剂）可降低体细胞中wnt5a和RA的蛋白水平。上述结果表明,Dennd1a可能通过PI3K-AKT和经典的wnt/β-catenin通路影响体细胞中wnt5a和RA的合成。结论:在本研究中,我们进一步阐明了 Dennd1a在胚胎期卵巢中分化和减数分裂的作用。Dennd1a可能通过调控体细胞中PI3K-AKT和wnt/β-catenin信号通路调节wnt5a和RA的生成,从而影响了与胚胎期卵母细胞的分化和减数分裂的启动,在体细胞中Dennd1a是卵母细胞分化和减数形成的必要条件,并对对卵母细胞分化和减数分裂的不同过程和阶段至关重要。