聚异丙基丙烯酰胺温度敏感性水凝胶(Poly N-isopropylacrylamide thermosensitive hydrogel, PNIPAAm Gel)是由异丙基丙烯酰胺、己内酯、甲基丙烯酸羟乙酯及右旋糖酐以化学沉淀的方式合成的具有环境温度响应特性的高分子聚合物。PNIPAAm Gel直接应用于大鼠梗死后心肌内,通过其类似正常心肌组织细胞外基质的三维空间结构实现梗死后受损细胞外基质的结构替代；通过促进梗死后心肌组织新生血管生成以改善梗死区局部微环境,增加梗死区室壁厚度以减少心室腔内应力,调节梗死后心肌组织胶原代谢以抑制胶原过度沉积,改善梗死后心肌舒张协调性以增加心肌收缩力,抑制梗死后左室负性重构,改善梗死后心功能；抑制梗死后增加的心肌细胞电不稳定性及复极不均一性以阻断梗死后恶性室性心律失常发生的电学基础,最终实现受损心肌组织的部分功能替代。血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors, ACEI)是冠心病心肌梗死患者治疗的经典药物,其能通过有效抑制梗死后表达增加的心肌组织血管紧张素Ⅱ (Angiotensin-Ⅱ, Ang-Ⅱ)及血管紧张素转化酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE)浓度,延缓甚至逆转梗死后心室负性重构。根据不同ACEI的药代动力学特点,可将其分为组织亲和性高的ACEI及组织亲性相对较低的ACEI,理论上,由于ACEI的高组织亲和性,可导致更强大的Ang-Ⅱ及ACE的抑制作用以及更持久的作用维持时间,然而,这一理论上的药理学优势是否能真正实现临床治疗终点指标的改善仍有待进一步研究。第一部分温度敏感性水凝胶抑制心肌梗死后心室结构重构的实验研究目的心肌梗死(myocardial infarction, MI)后细胞外基质过度降解及纤维瘢痕形成所致的负性心室重构是影响心肌梗死患者远期预后的主要因素。既往研究已经证实生物材料在抑制心肌梗死后心室重构方面的优越作用,而本课题组前期研究亦证实聚异丙基丙烯酰胺水凝胶(PNIPAAm Gel)能有效抑制梗死后心室重构,实现心肌梗死后心脏保护作用。然而目前关于生物材料作用机制以及生物材料内在的物理特性与其作用相关性的研究少之又少,本部分研究旨在探讨PNIPAAm Gel实现梗死后心脏保护作用的可能机制及其内在物理特性与其心梗后心脏保护作用的交互影响。方法化学沉淀法合成两种不同降解时间的PNIPAAm Gel(GelA,Gel B),昆明小鼠体内降解实验验证Gel A及Gel B的降解速率及完全降解时间。结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支制备心梗动物模型,假手术组只带线不结扎,随机分为：MI+磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS,MI+PBS)组,MI+GelA组,MI+GelB组,假手术+GelA(Sham+GelA)组,假手术+GelB组(Sham+GelB)组。冠脉结扎后5分钟内,分别将100μl3%GelA.3％GelB或PBS溶液分点注射入梗死区心肌内。假手术组注射部位及方法同心肌梗死组。饲养3个月后,行心脏彩超及血流动力学检测；H&E染色检测心梗面积；a-SMA免疫组织化学染色检测梗死区心肌新生血管密度以及梗死区离体心肌肌条收缩力检测。结果PNIPAAm Gel是一类具有环境温度响应特性的高分子聚合物,其具有类似正常心肌组织细胞外基质结构特点的三维空间结构。PNIPAAm Gel与PBS相比,其应用于梗死后心肌内：1、抑制左室扩张[LVEDD:MI+GelA组(77.13±2.45)mm,MI+GelB组(69.88±3.59)mm VS.MI+PBS组(107.57±4.85)mm,P<0.05;LVESD:MI+GelA组(51.0±5.37)mm,MI+GelB组(43.71±4.53)mm vs.MI+PBS组(86.86±3.7) mm,P<0.05]；2、增加梗死区室壁厚度[MI+GelA组(15.0±2.02)mm,MI+GelB组(16.25±1.06)mm vs.MI+PBS组(7.57±0.69)mm,P<0.05]；3、增加梗死后缩短的短轴缩短率[MI+GelA组(31.37±5.86)％,MI+GelB组(32.95±2.33)％vs.MI+PBS组(18.51±3.50)%,P<0.05]；4、增加左室压力最大变化速率[Dp/Dt:MI+GelA组(3107.46±131.53) mmHg/s,MI+GelB组(3925.05±73.74)mmHg/s vs.MI+PBS组(2596.94±253.85) mmHg/s,P<0.05；-Dp/Dt:MI+GelA组(3026.20±158.74)mmHg/s,MI+GelB组(3848.27±69.70)mmHg/s vs.MI+PBS组(2495.78±234.80)mmHg/s,P<0.05]；5、增加梗死后离体心肌肌条收缩力[MI+GelA组(80.09±1.19)mg,MI+GelB组(80.81±4.96)mg vs.MI+PBS组(40.27±0.85)mg,P<0.05]；6、缩短梗死后延长的离体肌条平均单次收缩时间[收缩时间：MI+GelA组(107.77±1.83)ms,MI+GelB组(105.15±2.16)ms vs.MI+PBS组(122.92±1.50)ms,P<0.05；收缩-舒张全程时间MI+GelA组(303.72±1.99)mg,MI+GelB组(300.74±1.99)mg vs.MI+PBS组(341.36±3.51)ms,P<0.05]；7、减少心肌梗死面积[MI+GelA组(55.15±0.87)％,MI+GelB组(51.23±1.80)％vs.MI+PBS组(63.60±1.28)%,P<0.05]；8、增加梗死后心肌a.SMA平均光密度[MI+GelA组(0.0394±0.0020), MI+GelB组(0.0393±0.0070)vs.MI+PBS组(0.0152±0.0023),P<0.05]。昆明小鼠体内降解实验证实Gel A及Gel B的降解规律基本一致,完全降解时间分别为85天及28天。在抑制梗死后左室扩展及改善左室压力最大变化速率方面,MI+GelB组表现出有统计学差异的优势。结论PNIPAAm Gel通过类似正常心肌组织细胞外基质的空间结构实现梗死后受损心肌组织的结构替代；通过促进梗死后心肌组织新生血管生成以改善局部微环境、增加梗死区室壁厚度以减少心室腔内应力,改善梗死后心肌舒张协调性以增加心肌收缩力,抑制梗死后左室负性重构及改善梗死后心功能,最终实现受损心肌组织的部分功能替代。第二部分温度敏感性水凝胶影响心肌梗死后胶原代谢的实验研究目的细胞外基质是维持心脏正常结构,促进心肌细胞生长、分化及功能实现的重要部分,而胶原纤维是构成心肌细胞外基质的重要组成部分。PNIPAAm Gel是一种具有类似细胞外基质空间结构的外源性生物材料,本部分研究主要探讨PNIPAAm Gel对于梗死后心肌组织胶原代谢的影响。方法本研究所采用的PNIPAAm Gel同第一部分研究,模型制备及实验分组亦同前。Wistar大鼠结扎冠状动脉左前降支制备心梗模型,假手术(Sham)组只带线不结扎,随机分为MI+PBS组,MI+GelA组,MI+GelB组,Sham+GelA组,Sham+GelB组。冠脉结扎后5分钟内,分别将100μ13%GelA,3%GelB或PBS溶液分点注射入梗死区心肌内。假手术组注射部位及方法同心肌梗死组。饲养3个月后,心肌组织切片Masson染色观察梗死区心肌胶原沉积,计算胶原容积分数；梗死心肌组织Western Blot检测TGF-β1蛋白表达、Real-Time PCR检测Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA水平,计算Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值。结果PNIPAAm Gel梗死后心肌内注射能明显抑制梗死区心肌组织胶原沉积,减少胶原容积分数[MI+GelA组(53.85±2.33)％,MI+GelB组(49.98±2.47)％vs.MI+PBS组(73.23±1.77)％,P<0.05]；Western Blot检测表明梗死后心肌组织TGF-β1蛋白表达明显增加,而PNIPAAm Gel与PBS相比,并不能有效抑制梗死后增加的TGF-β1蛋白水平；Real time-PCR检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA水平,计算其比值表明PNIPAAm Gel能明显抑制梗死后增加的Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值。结论PNIPAAm Gel可调节梗死后心肌组织胶原代谢,抑制胶原过渡沉积,该抑制作用不是通过TGF-β1这一胶原代谢的调节通路实现的,推测其可能与PNIPAAm Gel的“外源性补偿作用”相关。第三部分温度敏感性水凝胶影响心肌梗死后急性期心肌组织心电活动的实验研究目的现有研究证实心肌梗死后的心室重构包括结构重构及电重构。恶性室性心律失常是心肌梗死后的严重并发症,亦是评价心肌梗死患者预后的重要因素,目前其发生机制尚未完全阐明,而梗死后心肌组织电活动的不均一性被认为与心律失常的发生相关。现已证实PNIPAAm Gel能有效抑制梗死后心室结构重构,而既往研究也证实PNIPAAm Gel具有导电性,因此将其应用于梗死心肌组织内,是否会因其影响梗死心肌的电学特性而触发恶性心律失常,目前尚无相关研究。本部分研究探讨梗死后急性期应用PNIPAAm Gel对心肌组织心电活动的影响。方法本部分研究所采用的PNIPAAm Gel同第一部分研究中GelB。结扎兔冠状动脉左前降支制备心梗模型,假手术组只带线不结扎,随机分为MI+Gel组,MI+PBS组,Sham+Gel组,Sham+PBS组。冠脉结扎后5分钟内,分别将200μl3%Gel或PBS溶液分点注射入梗死区心肌内。假手术组注射部位及方法同心肌梗死组。持续监测体表心电图30分钟,以Curtis-Walker心律失常评分系统量化各组心律失常发生的严重程度。手术后30分钟、3小时和6小时行高位右房程序性电刺激(S1S2刺激),分别于梗死区及非梗死区心肌组织同步记录心内膜层、中层、心外膜层心电活动,计算心室有效不应期(ERP)、90%复极的单相动作电位时程(MAPD90)及跨室壁复极离散度(TDR)。结果Curtis-Walker心律失常评分表明,心肌梗死后心律失常发生明显增加,且多以恶性室性心律失常(室性心动过速、室颤)为主。PNIPAAm Gel较PBS能减少梗死后恶性室性心律失常的发生率。心肌梗死后ERP及MAPD90均明显缩短,而TDR则明显增加(P<0.05)。MI+Gel组与MI+PBS组相比,能明显增加梗死后缩短的ERP及MAPD90,同时抑制梗死后增加的TDR.此外,假手术组心肌组织心电活动并不受PNIPAAm Gel心肌内应用的影响。结论PNIPAAm Gel对正常心肌组织心电活动并无不良影响,亦不会增加心律失常的发生。PNIPAAm Gel通过影响梗死后心肌细胞除极及复极化过程,抑制梗死后增加的心肌电不稳定性及电不均一性,减少触发恶性心律失常的电学基础。第四部分不同组织亲和性血管紧张素转换酶抑制剂影响心肌梗死后心室重构的实验研究目的Ang-Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮(raas renin-angiotensin-aldosterone, RAS)系统重要的活性产物。现已证实ACEI能有效抑制心肌梗死后表达增加的Ang-Ⅱ水平,抑制梗死后心室负性重构。根据ACEI的药代动力学特点,含有与ACE结合较为牢固的羧基基团的苯那普利比含有巯基结合基团的卡托普利具有更强大且持久的ACE抑制效应,然而其临床治疗价值仍有待进一步评价。本部分研究以PNIPAAm Gel为载体,将理论上组织亲和性高及组织亲和性相对较低的两类ACEI直接应用于梗死后大鼠心肌内,探讨ACEI的组织亲和性与其实际作用疗效的相关性。方法本部分研究采用的PNIPAAm Gel同第一部分研究中GelB。Wistar大鼠结扎冠状动脉左前降支制备心梗模型,假手术组只带线不结扎,随机分为MI+PBS组,MI+Gel组,MI+Gel+Cap(卡托普利)组,MI+Gel+Ben(苯那普利)组,Sham+Gel组。冠脉结扎后5分钟内,分别将100μl PBS、3%Gel溶液、3%Gel/Cap (50mg/ml)溶液或3%Gel/Ben (10mg/ml)溶液分点注射于梗死区心肌内。假手术组注射部位及方法同心肌梗死组。饲养3个月后,心脏彩超、血流动力学检测心功能；梗死区离体心肌肌条收缩力检测；Elisa检测心肌组织Ang-II及ACE浓度；H&E染色检测心梗面积；a-SMA免疫组织化学染色检测检测梗死后心肌新生血管密度,Masson染色观察梗死区胶原沉积,计算胶原容积分数。结果与MI+PBS组相比,Gel/ACEI混合溶液治疗组与Gel单独应用组均能有效抑制梗死后左室扩展,增加梗死区心肌室壁厚度,改善短轴缩短率,增加左室压力最大变化速率,增加离体心肌肌条收缩力,抑制梗死后增加的Ang-II及ACE浓度,减少梗死区面积,增加梗死区新生血管密度及减少胶原容积分数。其中,MI+Gel/Cap组与MI+Gel/Ben组作用均优于MI+Gel组。在增加左室压力最大变化速率,减少梗死面积及降低胶原容积分数方面,MI+Gel+Cap组作用优于MI+Gel+Ben组；在抑制梗死后表达增加的Ang-II及ACE浓度方面,MI+Gel+Ben组表现最佳；在抑制梗死后左室扩展,增加梗死区心肌室壁厚度,改善短轴缩短率,增加离体心肌肌条收缩力,增加新生血管密度方面,MI+Gel+Cap组与MI+Gel+Ben组相比,差异无统计学意义。1、LVEDD:MI+Gel组(77.13±2.45) mm, MI+Gel+Cap组(69.75±0.95) mm, MI+Gel+Ben组(70.83±3.59) mm vs. MI+PBS组(107.57±4.85)mm, P<0.05;2、LVESD:MI+Gel组(51.50±5.37) mm, MI+Gel+Cap组(47.5±2.4) mm, MI+Gel+Ben组(40.60±6.71) mm vs. MI+PBS组(86.86±3.7) mm, P<0.05;3、梗死区室壁厚度：MI+Gel组(15.00±2.02)mm, MI+Gel+Cap组(12.75±0.48) mm, MI+Gel+Ben组(13.67±2.17) mm vs. MI+PBS组(7.57±0.69) mm, P<0.05;4、FS:MI+Gel组(31.37±5.86)%, MI+Gel+Cap组(31.91±3.24)%, MI+Gel+Ben组(31.49±5.74)%vs. MI+PBS组(18.51+3.50)%,P<0.05;5、Dp/Dt:MI+Gel组(3925.05±73.74)mmHg/s,MI+Gel+Cap组(6195.81±68.28) mmHg/s,MI+Gel+Ben组(5418.46±64.76)mmHg/s vs. MI+PBS组(2596.94±253.85) mmHg/s, P<0.05;-Dp/Dt:MI+Gel组(3848.27±69.70)mmHg/s,MI+Gel+Cap组(5978.52±98.44)mmHg/s,MI+Gel+Ben组(4734.45±67.96)mmHg/s vs. MI+PBS组(2495.78±234.80)mmHg/s, P<0.05;6、离体心肌肌条收缩力：MI+Gel组(80.81±4.96)mg,MI+Gel+Cap组(107.14±1.67)mg,MI+Gel+Ben组(106.8+6.98)mg vs. MI+PBS组(40.27±0.85)mg,P<0.05;7、梗死区心肌组织Ang-II浓度：MI+Gel组(1137.15±119.33)ng/ml, MI+Gel+Cap组(803.89±89.47)ng/ml,MI+Gel+Ben组(5418.46±56.32)ng/ml vs. MI+PBS组(1304.17±119.87)ng/ml, P<0.05;8、梗死区心肌组织ACE浓度：MI+Gel组(102.68±4.04)ng/ml,MI+Gel+Cap组(91.03±5.7)ng/ml,MI+Gel+Ben组(83.31±0.55)ng/ml vs.MI+PBS组(115.66±5.51)ng/ml,P<0.05;9、梗死面积：MI+Gel组(47.02±0.78)%,MI+Gel+Cap组(31.49±1.17)%,MI+Gel+Ben组(35.42±1.29)%vs.MI+PBS组(63.60±1.28)%,P<0.05；10、梗死区心肌组织新生血管密度：MI+Gel组(0.0393±0.0070),MI+Gel+Cap组(0.0409±0.0023),MI+Gel+Ben组(0.0374±0.0015) vs. MI+PBS组(0.0152±0.0023),P<0.05;11、梗死区心肌组织胶原容积分数：MI+Gel组(49.98±2.47)%,MI+GelB+Cap组(30.10±2.27)%,MI+GelB+Ben组(38.39±3.27)%vs.MI+PBS组(73.23±1.77)%,P<0.05。结论高组织亲和性的ACEI相比组织亲和性相对较低的ACEI,并未表现出有统计学差异的心肌梗死后心脏保护作用。其药代动力学上的理论优势与其真正实现治疗终点指标改善的相关性仍有待进一步研究。