论文部分内容阅读
流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种主要经蚊虫传播的人畜共患传染病,对人类健康与养猪业产生极大危害。JEV感染宿主细胞具有一个完整的复制周期,包括吸附、穿入、脱壳、合成、组装与释放。JEV非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白,其在JEV感染与复制过程中发挥重要作用。乙脑病毒作为一个结构较为简单的病毒,宿主与病毒蛋白之间的相互作用被认为是乙脑病毒致病的重要机制。本研究运用RNAi技术研究JEV NS3基因的沉默对体内和体外JEV增殖的影响,并利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选能与NS3蛋白互作的宿主细胞蛋白,旨在深入地了解NS3蛋白对JEV增殖的影响及其具体作用机制。本研究不仅为阐明乙脑病毒增殖机理提供重要理论依据,还为抗病毒药物靶点的研究开辟新的方向。1 NS3蛋白对乙型脑炎病毒增殖影响的研究设计了4个乙型脑炎病毒NS3基因的RNAi靶位点,分别位于JEV基因组4656-4676、4827-4847、4916-4936与5361-5381位,将其插入表达载体pGPU6/GFP/Neo中,构建了能够将shRNA导入细胞的重组表达质粒pGP-shRNA,并证明了shRNA质粒能够特异性抑制NS3基因的表达。将shRNA表达质粒转入BHK21细胞后,间隔24h感染JEV。JEV感染细胞72h后,收集病毒培养物,运用荧光定量PCR,空斑减少实验,间接免疫荧光与Western blot检测JEV增殖量的变化。结果显示4个shRNA表达质粒对JEV的增殖均有不同程度的抑制作用。其中pGP-NS3-4质粒（基因组5361-5381）抑制效果最为显著,其使细胞中JEV mRNA的含量降低93.9%；病毒滴度下降大约950倍；间接免疫荧光结果显示细胞中乙脑病毒数量明显减少,Western blot结果显示乙脑病毒结构蛋白E蛋白含量显著降低。将7日龄乳鼠分为7组,每组6只,4个pGP-shRNA质粒分别每只脑内接种2 μ g,接种24h后以10×LD50的剂量进行脑内攻毒,攻毒5d后,取鼠脑制成10%组织悬液,应用空斑减少实验测定病毒滴度。结果显示4个shRNA质粒均使乳鼠脑组织中JEV的病毒滴度显著降低,其中pGP-NS3-4质粒（基因组5361-5381）效果最佳,使毒价下降大约2400倍。又将pGP-NS3-4质粒接种3周龄小鼠,间隔24h以不同剂量攻毒,结果显示pGP-NS3-4质粒能为3周龄小鼠提供一定保护,10×LD50攻毒组保护率高达70%,50×LD50攻毒组保护率为60%。本研究证明了NS3蛋白对JEV的增殖具有重要作用,同时发现了JEV基因组5361-5381位是一个高效的NS3基因沉默靶位点,针对该位点的基因沉默对JEV在体内外增殖具有显著的抑制作用。该研究为乙脑病毒NS3蛋白功能以及其作为抗乙脑病毒靶点的深入研究提供了重要支持。2 乙型脑炎病毒NS3蛋白宿主细胞互作蛋白筛选以JEV野毒分离株SCYA201201为模板,扩增全长NS3基因,并将其插入pGBKT7载体构建了P GBKT7-NS3诱饵质粒。随后将诱饵质粒转化入酵母菌Y2HGo]d,获得了诱饵酵母菌,并对诱饵酵母菌进行了包括毒性、自激活验证和蛋白表达鉴定,结果显示NS3片段的插入对诱饵酵母菌没有毒性作用,NS3基因没有自激活作用并且诱饵酵母菌能成功表达全长NS3蛋白。采用Gold Yeast Two-Hybrid System系统将构建的诱饵酵母菌与人脑组织cDNA文库酵母菌进行酵母双杂交,连续在DDO/X/A 和 QDO/X/A营养缺失平板上筛选,经过三轮的筛选,最终获得了21个阳性克隆子。阳性克隆子经过扩大培养后,提取质粒并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,利用文库质粒的抗性筛选出单克隆,提取质粒并进行测序分析,结果显示除了8个重复序列、4个非编码区序列和1个移码突变序列外,最终获得了8个NS3宿主互作蛋白的编码基因序列,将这些序列在NCBI上进行Blast分析,结果显示它们与Genban k中的参考序列相似性均高达99%以上。随后将这8个文库质粒转入酵母菌Y187株,构建猎物酵母菌,并将之与NS3诱饵酵母菌进行回复杂交验证,同时设立文库菌自激活对照组,结果显示8个杂交菌落均呈现阳性,自激活对照组全为阴性,回复验证成功。本研究成功从人脑组织cDNA文库中筛选获得8个新的宿主互作蛋白,其分别是：腓骨蛋白FBLN5、蛋白磷酸脂酶PPP2CB、CRBN蛋白、G蛋白偶联受体GPR137B、泛素结合酶UBE2N、锌指蛋白ZNF350、热激蛋白Hsp40和信号复合体蛋白COP9。这些互作蛋白的成功筛选为深入研究NS3蛋白互作网络及NS3蛋白参与JEV增殖的机制奠定了重要基础。3 乙型脑炎病毒NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的验证本研究运用了免疫共沉淀技术验证宿主互作蛋白与乙脑病毒NS3蛋白的相互作用。首先提取人肾上皮细胞（293细胞）的总RNA并反转录成cDNA,以该cDNA为模板分别扩增出了8个互作蛋白的编码基因,并插入真核表达载体pCMV-HA构建了真核表达质粒。同时将乙脑NS3基因插入另一真核表达载体pEGFP构建了pEGFP-NS3真核表达质粒。将这些质粒分别转染入293细胞进行表达,Western blot结果显示乙脑病毒NS3蛋白与6个宿主互作蛋白可以成功表达。将NS3真核表达质粒与互作蛋白表达质粒一对一组合,共转染入293细胞,转染后培养24h,非变性裂解细胞,收集蛋白。运用免疫磁珠法沉淀蛋白互作复合物,收集共沉淀产物,进行SDS-PAGE与Western blot检测。结果显示宿主细胞中的热激蛋白Hsp40 （DNAJB6）可与乙脑病毒NS3蛋白在293细胞中发生相互结合,是乙脑病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白。本研究首次证实了热激蛋白Hsp40 （DNAJB6）是乙型脑炎病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白,该蛋白可能与乙脑病毒的增殖密切相关,本研究为NS3蛋白介导JEV增殖的分子机制的研究提供了重要支撑。