背景和目的:社会人口老龄化使老年性疾病成为重要的医学问题和社会问题。认知功能障碍几乎是老年性疾病中出现最早的、也是最普遍的,它也是脑血管疾病中最隐匿的一种。而很多研究显示,认知功能障碍多是由颈部动脉血管病变导致的。随着社会生活水平的提高,以及社会老年人口比重的越来越高,颈动脉发生粥样硬化,逐渐形成斑块,导致血管发生狭窄或闭塞,其发病率越来越高,对人群健康的危害也越来越大。因此,对于颈动脉狭窄(carotid artery stenosis,CAS)导致血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCT)的机制及如何预防和治疗,成为越来越多研究者的研究热点。流行病学调查和较多研究都提示:颈动脉狭窄的病人往往容易发生认知能力的损害。而其中病情较重的部分病人,甚至会有很高的发生痴呆的风险。动脉血管粥样斑块的形成是颈动脉狭窄及闭塞最主要的致病因素。颈动脉斑块,特别是位于颈内、颈外动脉分叉处的斑块,如果造成动脉的狭窄,会直接导致脑缺血性病变的发生。而针对斑块导致的狭窄进行治疗,在对大脑认知功能障碍的治疗中具有非常关键的意义。根据病人症状的不同,颈动脉狭窄在临床上可划分为两大类:有症状性颈动脉狭窄和无症状性颈动脉狭窄。有症状性颈动脉狭窄包括:颈动脉狭窄合并脑缺血表现、既往短暂性脑缺血发作或缺血性脑卒中等病史。而有症状性颈动脉狭窄会导致血管性认知功能障碍已经是是临床上公认的结果,而且往往造成较严重的后果。而无症状性颈动脉狭窄的患者,几乎没有神经系统的临床症状和体征。目前大部分的研究和调查中,关于无症状性颈动脉狭窄的病人,是否并发血管性认知功能障碍的结论较少。但各研究机构和学者一致认为:已经出现的颈动脉重度狭窄或闭塞、或发生斑块性溃疡的情况,是造成血管性认知功能障碍的高危因素。因此,近年来研究人员也越来越重视对无症状性颈动脉狭窄的研究。目前的一系列研究提示,认知功能障碍如果是由颈动脉狭窄引起的,那其作用机制可能为:1.脑血流供给不足。颈动脉狭窄会导致大脑血流供给不足、输入量下降。而慢性血流灌注不足造成脑缺血性病理改变,神经细胞代谢紊乱:细胞对葡萄糖的利用率降低、各种酶和蛋白质合成及分解出现紊乱等等。造成了脑血流长期灌注不足时脑额叶、海马中胆碱能系统功能障碍,导致神经递质合成减少、胆碱受体缺失、脑白质病变以及神经元破坏等。而这些改变可能是病人发生血管性认知障碍的病理生理学基础。2.颈动脉粥样斑块因血流冲击会发生分解、崩落。这些随血流运行的微小斑块成为小的栓子,顺血流堵塞终端血管,引起脑内出现多发的腔隙性梗死。而多发性微小腔隙性梗死,是作为中间媒介,在颈动脉狭窄导致认知功能损害的过程中发挥了作用。可能的原因是:这些栓子造成地腔梗损伤了位于额叶与基底节、内囊前肢/膝部之间的纤维连接,导致额叶功能受损,发生认知功能障碍。3.脑白质病变。已是各机构和学者一致认为的造成认知损伤的因素之一。颈动脉斑块的数量和体积,与大脑白质的病变范围及程度有正相关的关系。合并脑缺血症状的颈动脉狭窄病人,行颅脑MRI检查发现:在脑室周围及深部的白质都存在病变。而认知障碍的程度和类型与这些病变有很强的相关性。4.发生在颈动脉窦位置,特别是在颈动脉窦化学感受器或压力感受器位置出现的斑块,极可能造成这两种感受器出现功能障碍。感受器位置出现的斑块,也许会造成错误的低氧和血压降低信号,对这两种感受器造成错误的刺激。使交感神经系统出现一系列病态调节:神经功能亢进、脑血管调节功能紊乱等。甚至会造成凝血功能增强,继发炎症反应等一系列的病变,导致病人出现VCI。目前对于颈动脉狭窄、以及狭窄所导致的认知功能障碍的常规治疗方式,为手术解除狭窄和传统药物保守治疗。手术和药物治疗虽然可能改善这类病人症状。但不管是手术,还是药物治疗,都有其一定的局限性和风险性.手术本身存在的手术风险,病人自身身体条件的不佳:如伴有严重肺部疾病病人对手术的不耐受;严重冠心病病人的高死亡率;手术中可能出现的神经损伤;术后病变区再次形成斑块,导致反复狭窄甚至闭塞;支架内内膜细胞增生,造成支架再狭窄及闭塞;术后高灌注综合征和缺血再灌注造成神经功能的永久性损害;手术后大脑功能、包括认知功能改善机制的不确定性;病人症状改善的不显著性;乃至社会医疗安全和病人经济条件等原因,都制约了手术对治疗病人颈动脉狭窄的实施。而药物治疗,虽然有一定的治疗作用,但目前常见药物的疗效并不是特别的突出。特别是出现颈动脉狭窄后脑损伤,造成认知功能障碍的病人,不管是传统手术治疗还是药物治疗,效果都不尽人意,亟需更加有效的药物或者治疗方式的出现,以解决这一医学难题。研究发现,法国人同其它欧美国家地区人群一样,都有着罹患冠心病的高风险,如:高脂食物的大量食用、血液高甘油三酯水平、高血压病以及大量吸烟等。但无论是法国人的罹患冠心病的比率,还是他的死亡率,都比其他欧美国家和地区明显要低,而这一情况被称之为“法兰西悖论”(FrenchParadox)。而这一现象的原因,在大量的研究及调查后发现:是法国人进餐时喜欢饮用红葡萄酒。进而更加深入的研究发现,在红葡萄酒中的重要成分白藜芦醇(Resveratrol)发挥了降低冠心病发病率的主要作用。近年来人们对“法兰西悖论”的关注度越来越高,研究越来越深入,对白藜芦醇的各项作用也更加明确。白藜芦醇在自然界主要存在于:葡萄、虎杖、花生红衣、决明子等植物中。在新鲜的紫葡萄皮中含量最高。白藜芦醇具有非常多样的药用价值:如延缓肿瘤进程、抗氧化、抗动脉粥样硬化、降血脂及抗血小板、扩张血管、抗菌、镇咳、平喘作用。近年实验已证明,白藜芦醇能够增加缺血心肌周边毛细血管的密度,减少供血不足心肌的面积;在心肌和脑组织缺血及再灌注实验中,也能够降低心脑的急性损伤。白藜芦醇能避免血管内皮下胶原纤维的过度暴露,从而防止血管内皮细胞损伤。白藜芦醇也能降低促凝血物质的释放,预防血栓形成。目前已有多项研究发现,白藜芦醇对大脑神经元具有一定的保护作用;而且研究也发现白藜芦醇对某些中枢神经系统病变有治疗作用。尤其是近期提出的白藜芦醇对心、脑血管及神经系统的保护作用,使白藜芦醇成为研究的焦点和热点。体外实验已证实,白藜芦醇能降低神经元细胞受到的损伤。研究发现白藜芦醇能够保护神经元细胞,避免或减少缺氧、缺血和毒素造成的损害。白藜芦醇可以明显减轻体外培养的大鼠海马脑组织细胞,因长时间缺氧、缺血造成的损伤。小剂量的白藜芦醇就能够明显减轻在体外研究中非常经典的缺血缺氧细胞模型-氧糖剥夺损伤模型造成的神经细胞的坏死;有研究结果提出:白藜芦醇对新生大鼠脑片培养组织中的多巴胺神经元,有一定的保护作用。这些体外的实验研究,能更好的帮助我们理解白黎芦醇对各种神经损伤保护作用的机制。在许多体内实验中已经证实了白黎芦醇具有神经保护作用;对脑卒中动物模型进行的实验研究,发现:使用白藜芦醇对动物模型制造前进行预处理;或者动物模型制造后,使用白黎芦醇对其进行治疗,都可明显减少实验动物脑梗死体积,并降低脑组织的含水量,这表明白黎芦醇对脑卒中动物模型起到了神经保护作用。在研究大鼠动物模型的实验中,发现不同途径的白黎芦醇给药方式,都能够显著的减轻实验动物脑组织的损伤。另外也有实验证实,白黎芦醇能够改善大鼠动物模型的认知能力;通过行为学、组织学以及认知功能等不同的层面的实验研究,提示白藜芦醇在体内,对神经系统有一定的保护作用。不仅仅对缺血性脑病,白黎芦醇对出血性脑血管病,也有着同样的神经保护作用;而对于给药时间的研究发现:无论是成年鼠还是新生鼠,在神经损伤的同时或者是损伤后再给予白藜芦醇处理,都有神经保护作用;只是给药时间越晚,神经保护作用程度越低。大脑的认知功能与中枢胆碱能系统关系紧密;而乙酰胆碱(acetylcholine,ACh),又是胆碱能系统中和认知功能关系最为密切的神经递质,在中枢胆碱能系统中,乙酰胆碱分布十分广泛。对阿尔茨海默氏病(AD)患者发生记忆缺失的病因进行研究,发现其大脑中胆碱能神经元的减少是一个非常重要的致病因素。,神经元细胞胞质内的胆碱乙酰转移酶(Cholineacetyltransferase,ChAT)会把胆碱和乙酰辅酶A催化合成乙酰胆碱,并且释放到细胞外形成囊泡。在去极化过程中,乙酰胆碱经过胞外分泌到达突触间隙,与其受体(包括毒蕈碱和烟碱受体)结合,发挥作用。大脑中各种原因造成的乙酰胆碱和其受体水平的降低,导致了中枢胆碱能系统功能减退、进一步导致认知功能损害。因此,针对胆碱能系统的治疗一直是改善大脑认知障碍的重要目标之一。在本实验中,我们拟通过动物实验,制备动物模型,并对实验动物实施Morris水迷宫实验;观察使用白藜芦醇治疗能否改善实验大鼠受损的认知能力,从而来证实白藜芦醇是否具备神经保护作用。并通过研究及实验,观察在颈动脉狭窄大鼠大脑海马胆碱能系统中,三个关键酶:胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和囊泡乙酰胆碱转运酶(Vacht)的表达,及大脑中这三种酶mRNA表达的水平有无变化,探讨白藜芦醇是否是通过胆碱能系统起到神经保护功能,并明确其作用机制。方法:本实验选取30只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,将它们随机分为3组,每组各10只:分别为假手术组(Sham)、模型组(Model)和治疗组(Tau)。对模型组大鼠进行手术,建立颈动脉狭窄动物模型;对治疗组大鼠同样建立狭窄动物模型,并采用白藜芦醇治疗;而假手术组大鼠只实施颈动脉游离。首先,建立大鼠颈动脉狭窄实验模型。使用水合氯醛对大鼠实施腹腔注射麻醉,然后将其固定在手术台上,采用颈正中切口,逐层切开、分离,暴露双侧颈总动脉。在模型组和治疗组,游离大鼠双侧颈总动脉后,用0号手术丝线结扎。对于假手术组大鼠,仅游离双侧颈总动脉,未予以结扎。手术后每只大鼠肌肉注射青霉素以避免感染。大鼠术后可自由进食、进水。建模完成后,称量每只治疗组大鼠的重量,以100mg/Kg的剂量,予以每一只大鼠白藜芦醇入胃给药,4周时间内一天一次。给予模型组和假手术组大鼠注射等量无菌生理盐水作为对照。饲养大鼠4周,然后对各组大鼠进行Morris水迷宫试验,评测实验大鼠的认知能力。实验中使用电脑跟踪系统记录:①大鼠穿越平台多少次;②大鼠在平台附近保持多少时间;③大鼠到达平台的距离。Morris水迷宫实验结束后,使用戊巴比妥钠将大鼠麻醉,立即将大鼠断头、去脑,分离海马。称重后,将其放入玻璃匀装管中,制备匀装液,离心后取上清液放Eppendorf管内,并放入-20℃冰箱冷藏备用。其余所有的脑组织标本在-80℃条件下保存,以待进行进一步生化分析。测定AChE活性。原理:采用Ellman的方法测定乙酰胆碱酯酶的活力,通过测定乙酰胆碱的分解产物5-巯基-硝基苯甲酸在412nm吸光度的增加速率,检测AChE的活性。测定ChAT活性:ACh在ChAT作用后,底物之一为乙酰辅酶A,它可结合显色剂,于324纳米处通过吸光度予以测定含量。采用qRT-PCR检测大鼠海马AChE,ChAT和Vacht的mRNA表达。结果:1.水迷宫试验中,假手术组大鼠的逃避潜伏期表现出持续缩短的模式,表明本组学习能力未受影响。在模型组,逃避潜伏期没有持续缩短,而且远远高于假手术组。在治疗组,经过白藜芦醇治疗,观察到与假手术组相同的模式,即逃避潜伏期随着训练进行而持续下降。虽然与模型组相比,治疗组的逃避潜伏期仍高于假手术组,但是其潜伏期大幅度降低,表明白藜芦醇能够部分恢复大鼠认知学习能力。2.白藜芦醇增加了大鼠海马的AChE,ChAT和Vacht的表达水平。本实验研究,测量了大鼠海马的AChE,ChAT和Vacht的表达水平。在模型组大鼠中,所有这些酶表达水平明显降低,表明颈动脉狭窄导致的脑损伤降低了这些酶的产生。使用白藜芦醇治疗后治疗组大鼠,所有这三种酶的表达水平尽管不如假手术组高,但是均比模型组有所增加。测量中枢胆碱能系统中关键酶AChE和ChAT的活性:假手术组大鼠AChE活性为0.68±0.04U·mg-1pro,而模型组AChE活性降低至0.36±0.05U·mg-1pro。白藜芦醇治疗后,治疗组大鼠AChE活性增加到0.49±0.02U · m g-pro。ChAT活性观察结果相似,假手术组的活性为165.53±1.95U·mg-1pro,明显高于模型组 105.74±2.64U·mg-1pro。白藜芦醇治疗能够将ChAT活性提高到136.82±2.45U · m g-1pro。3.通过RT-PCR对AChE,ChAT和Vacht的mRNA表达水平进行检测:与假手术组相比,模型组大鼠所有三个酶的mRNA水平均显著降低。治疗组经过白藜芦醇治疗,这三个酶的mRNA得以增加,高于模型组。结论:1.白藜芦醇缩短了颈动脉狭窄闭塞认知受损大鼠的逃避潜伏期治疗组大鼠的逃避潜伏期随着训练进行而持续下降。治疗组大鼠的逃避潜伏期虽然仍高于假手术组,但与模型组相比,其潜伏期大幅度降低,表明白藜芦醇能够恢复部分学习认知能力。2.白藜芦醇提高了认知障碍大鼠的认知记忆功能模型组大鼠在三项措施中表现出一致的结果,表明颈动脉狭窄条件下的认知障碍和学习能力下降,他们降低了跨越平台的次数和保持在平台附近的时间,并增加了到达平台的逃离距离。而在用白藜芦醇治疗的治疗组中,大鼠表现出了一定的认知学习能力的改善,其测定结果位于假手术组和模型组之间。3.白藜芦醇改善AChE和ChAT的活性本实验中,检测了中枢胆碱能系统中AChE和ChAT关键酶活性:假手术组大鼠AChE活性为0.68±0.04U ·m g-1pro,而模型组AChE活性降低至0.36±0.05 U ·mg-1 pro。白藜芦醇治疗后,治疗组大鼠AChE活性增加0.49±0.02 U ·m g-1pro。ChAT活性观察结果相似,假手术组的活性为165.53±1.95 U·m g-1 pro,明显高于模型组105.74±2.64U · m g-pro。白藜芦醇治疗能够将ChAT活性提高到 136.82±2.45U · m g-1pro。4.白藜芦醇增加了大鼠海马的AChE,ChAT和Vacht的表达水平测量大鼠海马的AChE,ChAT和Vacht的表达水平。在模型组大鼠中,所有这些酶的表达水平明显降低,表明颈动脉狭窄导致脑损伤降低了这些酶的产生。在治疗组大鼠大脑海马中,所有这三种酶的表达水平尽管不如假手术组高,但是均比模型组有所增加。这些结果表明,白藜芦醇能够影响这些酶的表达,而白藜芦醇也是通过他们能够在认知功能保护方面发挥作用。5.白藜芦醇上调大鼠海马AChE,ChAT和Vacht的mRNA表达我们也通过RT-PCR研究了 AChE,ChAT和Vacht的mRNA表达水平,与假手术组相比,模型组大鼠所有三个基因mRNA水平均显著降低。治疗组经过白藜芦醇治疗,这三个基因的mRNA表达增强。意义:本研究表明,白藜芦醇的治疗可以改善大鼠颈动脉狭窄闭塞后认知能力的损害。白藜芦醇的治疗作用,可能是改变大鼠海马胆碱能系统中三个关键酶的表达,来发挥作用的。这些结果表明,白藜芦醇的神经保护功能可能是通过胆碱能系统起到作用,并且白藜芦醇有可能成为一种用于治疗颈动脉狭窄病人认知功能障碍的潜在药物。