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猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍和流产的重要病原之一。PPV主要通过呼吸道、消化道和胎盘传播,带毒的各类猪群都可传播该病。PPV感染呈世界性流行,且在我国许多猪场流行,严重地影响着养猪业的发展,因此一直是猪病研究的热点之一。目前对PPV的研究主要集中在检测方法以及疫苗上,对其感染机制的相关研究报道较少,特别是对于病毒与宿主相互作用的研究报道较少,严重制约了新型疫苗和新型药物的研发。为此,开展PPV与宿主细胞相互作用机制研究和研发PPV的抗病毒药物和有效疫苗已变得极其紧迫。Toll样受体（TLRs）是一种可以识别特定的微生物病原体的跨膜信号转导受体,其活化在机体完成各项生命活动时发挥了重要作用。实验室前期研究结果显示,在PPV感染PK-15细胞后,能够引起细胞炎性因子IL-6和NF-κB在m RNA水平的变化。所以我们推测,PPV可能是通过NF-κB信号通路调控细胞炎性因子的表达。本试验结合NF-κB通路在病毒感染中的作用,对二者的作用关系开展相关研究。首先试验证实PPV感染PK-15细胞后激活NF-κB信号通路,其次研究了PPV通过TLR2受体来激活信号通路,最后再次证实TLR2介导PPV NS1激活NF-κB信号通路,具体试验结果如下:1.为了证实PPV感染细胞时是否激活了NF-κB信号通路,试验采用Western blot技术来检测PPV感染PK-15细胞后NF-κB整个通路中各个蛋白的表达情况。PPV感染PK-15细胞后分别在0、3、6、12、24、36、48和60 h收取样品进行检测。结果显示PPV感染后IκBα在3和6 h表达量增加,12 h表达量减少,24 h表达量升高,随后一直呈下降趋势,这说明IκBα发生了降解。对p65磷酸化蛋白（p-p65）的检测结果显示,PPV感染后总的p-p65表达量3 h达峰值,随后表达量减少;胞浆内p-p65表达量在PPV感染后呈下降趋势;而细胞核内的p-p65表达量在病毒感染后3和6 h变化不明显,24 h达到峰值,随后呈下降趋势。试验进一步用间接免疫荧光技术来观测p65转位进入细胞核的情况,PPV（MOI=1）感染PK-15细胞36 h后,固定细胞,封闭后孵育一抗二抗,荧光显微镜下观察到PPV感染组p65大部分在细胞核中表达,而未感染组的p65仍在胞浆内,说明PPV感染后促进了p65的入核。接着又检测了NF-κB信号通路中其它各个蛋白（My D88、IRAK1、TRAF6、TAK1）的表达量变化情况,试验结果显示细胞内My D88在PPV感染PK-15细胞后12 h表达量下降,24 h表达量升高,随后呈下降趋势。IRAK1的表达水平在感染12 h前呈现下降趋势,在24 h之后表达量升高。TRAF6的表达水平在PPV感染后表达量增加,6 h达到峰值,随后逐渐降低,24 h时表达量升高,随后呈下降趋势。TAK1在PPV感染后表达量呈上升趋势,24 h达峰值,随后呈下降趋势。这些结果表明PPV感染PK-15细胞后通过一系列级联反应激活整个NF-κB信号通路。高,为了进一步探明PPV是否是通过TLR2激活NF-κB信号通路的,本试验采用Western blot技术检测PPV感染细胞后TLR2在不同时间的表达情况。结果显示PPV感染细胞后TLR2的表达量在12 h达到峰值,随后表达量减少,说明PPV通过TLR2来进行传递信号。随后设计了TLR2的两对特异性si RNA引物（si RNA210和si RNA662）,经预试验确定了si RNA的最佳工作浓度为150 pmol。PPV（MOI=1）感染转染过si RNA的PK-15细胞后,分别在24、36和48 h收取细胞样品,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测TLR2的表达情况。结果显示,与未转染si RNA的试验组相比,转染了si RNA的试验组的TLR2表达量均下降;进一步检测了24、36和48 h NF-κB和IL-6的m RNA表达量变化,发现NF-κB和IL-6的表达量均受到不同程度的抑制。以上结果证实PPV通过TLR2受体激活NF-κB信号通路调控IL-6炎性因子的表达。2.实验室前期已在m RNA水平上检测到TLR2、NF-κB和IL-6在感染病毒后表达量升3.实验室前期成功构建了PPV NS1重组表达质粒,将其转染293T细胞后检测结果发现NF-κB和IL-6表达量升高。为了进一步验证PPV NS1重组表达质粒是否通过TLR2引起炎性反应,该试验将p EGFP-N1-NS1转染PK-15细胞和293T细胞两种细胞系5 h后转染TLR2 si RNA,连续培养24、36和48 h收取细胞样品。实时荧光定量PCR检测结果显示,PK-15细胞和293T细胞中NF-κB表达量受到抑制,其中si RNA210干扰组中NF-κB的表达量比重组质粒组中的表达量分别下降2.5倍和约1倍,si RNA662干扰组中NF-κB的表达量相比重组质粒组表达量下降了1.2倍和6倍;两种细胞系中IL-6的表达量均呈下降趋势,si RNA210干扰组相比重组质粒组表达量分别下降7倍和1.5倍,两种细胞系中si RNA662干扰组相比重组质粒组表达量都是下降了近1倍。本试验证实了PPV能激活NF-κB信号通路,运用si RNA技术证实PPV通过TLR2感染PK-15细胞上调NF-κB和IL-6的表达量,也证实了TLR2介导PPV NS1转染细胞促进NF-κB和IL-6的表达量上调,本项研究成功证实了PPV通过TLR2感染PK-15细胞激活NF-κB信号通路进而调控炎症反应。