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背景和目的：胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤疾病中其发病率排第四位,死亡率排第三位,2008年的统计数据显示该年胃癌全球新发病例数和死亡数分别为989,600和738,000,分别占8%的肿瘤发病数和10%的死亡数,超过70%的新增病例和死亡数发生在发展中国家,其中仅中国就占42%。患者在发病初期往往无明显不适症状,由于缺乏敏感性高的早期胃癌标志物检测,以及没有有效的治疗手段是发病率和死亡率居高不下的主要原因。现在使用基因组学和蛋白组学技术已筛选出一些新的癌基因和抑癌基因,但其确定作用和机制尚待进一步研究。肝肠钙粘连蛋白(liver-intestine cadherin, Li-cadherin, CDH17)是近年来发现的一种钙粘素家族新成员,与经典的E/P-cadherin钙粘连蛋白胞内域含160个氨基酸序列不同,它的胞内域仅有18个氨基酸序列,其胞内域不同传统的β连环蛋白和γ连环蛋白相连接,CDH17如何通过胞内结构发挥其粘附作用至今尚不清楚。CDH17最初发现在大鼠的肝细胞和肠上皮细胞上表达,在人类仅在肠上皮和胰腺导管上皮中少量表达,胃部及肝脏在正常人体中并不表达。近年的研究在结直肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌及barreet食管中均发现了CDH17蛋白的异常表达或基因异常异常剪切,提示CDH17在消化道肿瘤的发生发展过程中可能起着一定的作用。本课题组的前期研究亦发现在慢性萎缩性胃炎肠化生组织中CDH17表达增高,低分化胃癌组织中CDH17表达显著高于中高分化胃癌组织,同时CDH17的表达和Galectin-3在胃癌组织中表达负相关。文献报道的结果均提示CDH17在胃癌中可能其着作用,但也有不一致的地方,如有些研究提示CDH17的表达量增高和TNM分期正相关,而有些研究提示CDH17的表达量增高和TNM分期负相关。所以关于CDH17在胃癌发生发展中究竟起着促进还是抑制作用目前尚存在争论。鉴于此,本实验在沉默胃癌细胞的CDH17基因后,检测并比较胃癌细胞在体内体外的增值和侵袭转移能力变化,以明确CDH17在胃癌发生发展过程中的作用。方法：1、根据在线设计软件设计合成四对针对靶基因CDH17的pre-miRNA干扰序列,构建带有报告基因GFP的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-CDH 17干扰质粒,经PCR和测序鉴定质粒构建成功后,应用LipofectamineTM2000介导pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-CDH17干扰质粒转染BGC823细胞,利用实时定量PCR技术和Western技术分别从mRNA和蛋白水平检测各质粒的干扰效果,从而选出干扰效果最好的RNA干扰序列以进行下一步慢病毒载体构建。将鉴定出的干扰效果最佳的miRNA干扰质粒抽提后,应用Gateway重组反应技术进行BP/LR重组,构建针对靶基因CDH17的慢病毒表达克隆pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-CDH17,测序鉴定后,和ViraPowerTM混和包装质粒共转染293FT细胞,产毒后进行病毒滴度测定。将重组慢病毒干扰体系感染胃癌BGC823细胞,经灭瘟素筛选后,利用实时定量PCR及Western blot技术分别检测干扰后CDH17mRNA及蛋白的表达变化情况,同时通过免疫荧光技术观察细胞蛋白表达情况。2、流式细胞仪检测慢病毒转染BGC823细胞的转染率；以CDH17-NEG细胞和无处理BGC823细胞作为对照组,运用MTT法检测CDH17干扰后细胞增殖能力和细胞粘附能力；P1/Rnase染色-流式细胞分析法检测CDH17干扰后细胞周期；TRANSWELL小室法检测CDH17干扰后细胞迁移和侵袭能力。3、将BGC823, CDH17-NEG, CDH17-MIR细胞悬液分别接种于三组裸鼠皮下,测量裸鼠皮下瘤体体积,绘制皮下肿瘤生长曲线,6周后处死裸鼠行瘤体HE染色和免疫组织化学检测,并检测远处脏器转移情况。为了检测CDH17对肿瘤远处转移的影响,皮下瘤剪碎后进行原位种植,将瘤块接种于胃大弯浆膜层,4-6周后处死裸鼠观察瘤体生长和远处脏器转移情况。结果：1、流式细胞仪计数转染GFP蛋白细胞数,结果显示转染后72小时,CDH17miR慢病毒感染组的转染效率为98.8%。通过实时定量PCR及Western blot技术分别检测miR重组慢病毒感染BGC823细胞后CDH17 mRNA及蛋白表达变化情况发现,CDH17 miR慢病毒感染组mRNA及蛋白表达量均显著低于未处理组和慢病毒阴性对照感染组(P<0.05),表明我们所构建的CDH17 miR重组慢病毒表达克隆能够特异并有效的在mRNA及蛋白水平沉默CDH17基因的表达,通过免疫荧光技术,我们可以更直观的观察到细胞内CDH17蛋白表达的下降。2、在慢病毒介导的miRNA干扰细胞后,CDH17-MIR细胞增值速度显著减慢,在24h、36h、48h较CDH17-NEG细胞和无处理对照BGC823细胞组增值速度差异明显,具有统计学意义(P<0.05),无处理BGC823组和CDH17-NEG组细胞之间细胞增殖速度相比,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞迁移实验中CDH17-MIR组迁移细胞数明显少于BGC823组和CDH17-NEG组,差异均有显著统计学意义(P<0.01),抑制率为71.7%,BGC823组和CDH17-NEG组之间差异无统计学意义(P>0.05)。细胞侵袭实验中,CDH17-MIR组的穿膜细胞明显少于BGC823组和CDH17-NEG组,抑制率为77.8%,与BGC823组和CDH17-NEG组差异均有显著统计学意义(P<0.05)。BGC823组和CDH17-NEG组之间差异无统计学意义(P>0.05)。CDH17-MIR细胞的粘附能力较CDH17-NEG组和无处理BGC823细胞组明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),BGC823组和CDH17-NEG组之间差异无统计学意义(P>0.05)。细胞周期实验显示CDH17-MIR细胞与CDH17-NEG细胞和BGC823细胞两组细胞相比,S期细胞所占比例显著减少,G0和G1期细胞所占比例则显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01)；G2//M期细胞三组间差异无显著统计学意义(P>0.05)。CDH17-NEG组和无处理BGC823细胞组相比,各期细胞所占比例差异无统计学意义(P>0.05)3、CDH17-MIR细胞组皮下肿瘤生长速度显著降低,与CDH17-NEG细胞组及未处理BGC823细胞组相比差异具有统计学意义(P<0.01),而CDH17-NEG组和未经处理BGC823细胞组相比,皮下肿瘤生长速度差异无统计学意义(P>0.05)。ICH结果显示CDH17-MIR组细胞CDH17蛋白表达显著下降。裸鼠皮下成瘤模型处死后摘取心、肝、肺、肾等重要脏器及腹部淋巴结,HE染色后显微镜下观察肿瘤远处转移灶,结果显示在三组中各脏器均未观察到明显转移灶。原位成瘤实验结果显示在第四周三组裸鼠均未观察到远处脏器转移,第六周BGC823组观察到3例肝转移和2例肺部转移灶,CDH17-NEG组观察到3例肝转移和2例肺部转移灶,CDH17-MIR组观察到1例肝转移和1例肺部转移灶。结论：为了研究CDH17在胃癌生长和转移中的作用,我们构建了慢病毒载体介导的CDH17miRNA干扰体系,结果显示慢病毒介导的该干扰体系可高效的转染细胞,并有效抑制CDH17mRNA和蛋白的表达。在细胞各项生物学功能检测中发现CDH17表达下降后,其增值能力和粘附能力显著下降,细胞周期分析显示干扰组细胞处于G0/G1的比例显著增高,S期细胞显著减少。matiigel小室实验显示细胞迁移和侵袭能力亦显著下降。在体内皮下成瘤和原位成瘤实验中,CDH17干扰组肿瘤的增值、侵袭和转移能力较正常组显著下降,和体外实验结果相一致。总之,我们的实验初步证实CDH17干扰后胃癌细胞体内和体外的增值和侵袭能力均显著下降,CDH17在胃癌生长和转移过程中起着促进作用,可能在未来成为靶向治疗的目的蛋白。