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茶,因其健康功能和宜人的香气,普受国内外消费者的欢迎。茶树挥发性萜类物质是茶叶香气的重要组成成分,也是决定茶叶品质与风味的重要因素。茶树萜类代谢机理和进一步的调控,需要借助转基因技术手段。目前,茶树转基因技术尚不成熟,难以获得转基因茶树。本实验通过生物信息学技术,从已获得的茶树基因序列中,找到了部分茶树萜类代谢上游基因,并通过代谢前体的饲喂,研究了代谢产物对这些基因表达的调控,旨在探明茶树内源萜类代谢上游途径中的关键酶和关键步骤。此外,本研究利用根癌农杆菌介导茶树愈伤组织进行转化,试图建立起茶树转基因体系。
主要研究结果如下:
1.通过对茶树转录组和基因组部分测序结果的比对分析,鉴别出MVA和MEP途径中主要的基因组分(AACT,HMGS,HMGR;DXR,CMK,HDS;IDI,FPPS),并根据已知植物萜类前体的代谢途径,推测出茶树中IPP,DMAPP,单萜生物合成可能的代谢途径。通过对茶树愈伤组织及叶圆片液体培养时外源前体的饲喂,定量分析此代谢途径中不同基因的表达水平。结果表明:在饲喂前体Acetyl-CoA后,CsHMGS和CsHMGR基因的表达量最高分别达到3和2.5倍;在饲喂前体DXP后,CsDXR、CsCMK、CsHDS基因的表达量最高分别达到1.7、2.3和1.5倍,从而,证实CsHMGS、CsHMGR、CsDXR是的表达明显受到代谢前体的促进。CsIDI和CsFPPS基因在前体DXP、IPP和DMAPP饲喂后表达量都提升2倍左右,说明CsIDI和CsFPPS基因的表达明显受到直接代谢前体IPP的促进,同时在茶树MVA和MEP途径中,生成中间产物IPP的主要途径是MEP途径。
2.利用农抗早茶树[Camelliasinensis(L.)0.Kuntze]品种的叶片进行培养,诱导形成愈伤组织。选择生长旺盛、致密的愈伤组织块与菌株为EHA105的根癌农杆菌进行共培养,利用潮霉素(Hygromycin)进行抗性筛选,通过GUS染色及PCR的验证,证明试验获得部分转基因愈伤组织,在添加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)处理后的转化率大约在12.5%左右,存在转化率较低的问题。同时实验结果证明,AS的加入可以有效的提高农杆菌的转化效率,而负压的增加却不能提高转化率。
上述结果对于揭示茶树挥发性萜醇类物质合成及基因调控技术,增进成茶的香气品质,具有重要理论意义和应用价值。