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研究背景： 人胎盘来源间充质干细胞（hPMSCs）以其来源丰富、低免疫原性、非侵入易获取和无伦理学限制等诸多优势成为细胞移植治疗的优势种子细胞。如何在体外培养环境中，维持其生理特性成为研究热点。胎盘在体内处于生理性低氧微环境（1-5%O2），因此hPMSCs也处于该浓度范围，而体外常规细胞培养为21%O2。我们前期实验已证实氧浓度的改变对细胞生物学特性产生影响。不同氧浓度对hPMSCs的代谢组学是否产生影响，有待进一步研究。 最近研究发现，化学同位素标记的液相色谱-质谱联用（CIL LC-MS）克服了常规LC-MS的离子抑制、基质效应和仪器漂移等缺点。CIL LC-MS将样品归一化策略和同位素标记相结合，以提高检测的灵敏度和代谢物组分的覆盖率以及定量的精准度。12C-/13C-丹酰化标记的LC-MS已被证明是分析含胺/酚代谢物的有效方法，可用于分析不同类型的生物样品，如细胞、血浆、粪便等。 研究目的： 用基于化学同位素标记的CIL LC-MS的代谢组学方法来分析生理性低氧浓度（5%O2）和常规培养细胞的氧浓度（21%O2）两种培养条件下hPMSCs的代谢谱差异。探讨体外培养的 hPMSCs在缺氧环境下内源性代谢物的变化模式，鉴定缺氧相关的生物标志物，揭示低氧浓度对hPMSCs代谢通路的影响，为将来优化培养方法奠定实验基础。 研究方法： 1、细胞培养：选取3-5 代hPMSCs用于实验。细胞状态稳定后，将低氧组细胞置于5%O2、5%CO2.培养，常氧组细胞继续在21%O2、5%CO2中培养。 2、一般生物学特性检测：通过流式细胞技术测定不同氧浓度下细胞的大小、表面标志、细胞周期；细胞计数测定用以绘制不同条件下细胞生长曲线；成脂、成骨分化以及实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）评估不同氧浓度下细胞分化潜能。 3、样本采集、制备与标记：连续3天，每12h采集样本（细胞和相应培养液）。细胞加入-20℃预冷1/1(v/v) 甲醇/水淬灭萃取，并通过磁珠协助其裂解。同时，将200μl 培养液与600μl 冷甲醇混合提取代谢物。取含代谢物的上清液室温干燥,干燥后重新溶于质谱级水，进行丹酰化标记。12C-丹酰氯化物用于标记个体样本，13C-丹酰氯化物用于标记混合样本。混合样本通过混合相同摩尔量的个体样本制备。 4、样品归一化与检测：基于液相色谱-紫外分析（LC-UV）将 12C-标记的个体样品定量，根据定量结果，将等摩尔量的 12C标记的个体样品和 13C标记的混合的样品，均匀混合以进行色谱-质谱（LC-MS）联用分析。所有样品在LC-MS运行期间随机进样，进样体积固定在10μl。 5、数据处理：用IsoMS等软件对原始数据进行预处理，将处理后的数据进行多变量和单变量统计分析。根据精确的质荷比到 HMDB（www.hmdb.ca）和EML （http://mycompoundid.org）数据库进行搜索，确定可能的物质，并基于质荷比和保留时间，在丹酰标准库进行代谢物鉴定。最后，通过MetaboAnalyst 3.0 (www.metaboanalyst.ca)分析代谢途径。 研究结果： 1、一般生物学特性：低氧对hPMSCs的免疫表型没有影响，但低氧培养时细胞体积更小。5%O2培养较21%O2培养的细胞提早进入倍增期，且增长率和细胞周期的S期增高。hPMSCs的成脂、成骨分化结果表明低氧组较常氧组钙盐沉积增加、脂滴增多及相关成骨、成脂基因表达升高。 2、代谢物的鉴定：我们分别在细胞和培养上清液中检测到2987和2860个 12C/ 13C峰对。通过搜索HMDB、EML和丹酰标准库，大约86.0%的细胞峰对和84.3%的培养上清液峰对可以被鉴定或者被推定，其中明确鉴定了63个细胞和52个培养上清的代谢物。 3、多变量数据分析结果：无监督的主成分分析（PCA）显示低氧组和常氧组无明显分离。正交偏最小二乘法 （OPLS）分析显示两组之间有良好的分离，说明氧浓度可以改变细胞和培养上清的代谢组学特征。火山图显示培养上清液中代谢物的变化数量远少于细胞中变化的数量(45 vs 550)。 4、缺氧相关生物标记物：我们从细胞中确认了10个缺氧标志物，从培养上清中确认了6个相关标志物，其中hPMSCs明确鉴定了7个（L-精氨酸，瓜氨酸， L-脯氨酸，苏氨酸，5-甲硫腺苷，泛酸和γ-氨基丁酸（GABA）），培养基鉴定了3个（丙氨酸，甘氨酰-L-亮氨酸和甘氨酰 - 苯丙氨酸）。 5、代谢途径：基于以上的缺氧相关生物标志物，我们发现低氧组细胞的精氨酸，瓜氨酸，脯氨酸和泛酸相对含量明显下降，而γ-氨基丁酸的含量明显上升。同样，培养上清液的丙氨酸含量明显上升。这些变化扰乱了精氨酸和脯氨酸代谢，泛酸和辅酶A（CoA）的生物合成以及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代谢。 结论： 本研究表明生理性低氧浓度对hPMSCs的免疫表型无显著影响，有利于原始形态的保持，可促进细胞的增殖和分化；细胞代谢活性发生了改变，促进了精氨酸和脯氨酸代谢，泛酸和CoA生物合成以及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。