食源性疾病(包括食物中毒)在人类疾病中占据很大的比例，微生物污染造成的食源性疾病仍是我国食品安全中最突出的问题。根据国际食源性病原菌所致危害的严重性，以及我国食物中毒的病原谱，沙门氏菌应列为首选控制的食源性致病菌。为提高我国食品卫生工作的声誉，树立良好的国际形象，食品安全保障工作的一项重要任务，就是要求具备迅速扑灭食源性疾病的快速反应能力，而快速、准确的检测技术是上述能力的基本保障。为适应食品卫生工作新形势的需要，采用致病菌分子分型技术对致病微生物进行溯源和流行病控制，以判定微生物的同源性，追溯致病食品的共同来源，从而追踪到生产源和所有分发渠道，大大缩短查找致病食品的时间，从根本上迅速控制食源性疾病的传播，最大限度地减少人民群众的身体健康危害，是亟待解决的问题。 因为细菌是通过二分裂进行增殖的，所以传代细菌之间具有相同的基因物质。这种介于细菌传代之间的相似的遗传物质是鉴别共同来源的致病菌极好的工具。随着分子生物学手段的不断发展，从DNA水平对致病菌进行分型及鉴定已成为可能。本研究从我国沙门氏菌最常见的血清型—肠炎沙门氏菌出发，对其分子分型方法进行了研究。 DNA是细菌的遗传物质，因此细菌的变异及进化均来源于DNA分子的核苷酸序列发生的变化。各种分子分型的方法大多建立在基因组DNA序列差异的基础上，并且最终多采用电泳带型来作为分型的依据，但图谱的比较存在着识别的困难以及各个不同的研究之间难以互相比对的局限性。近年来新近发展的一种新的实验方法--多位点基因序列分析(multilocussequencetyping，MLST)中，提出了选用多个管家基因进行序列分析的方法，在实验过程的可操作性及实验结果的可靠性之间取得了宝贵的平衡。由于该方法结果明确，具有良好的实验室间的可比性，因此已被广泛应用于细菌的分型研究中。MLST在我国目前的研究领域中尚属空白，为早日和国际先进技术接轨，并为建立我国的食源性致病菌监测网络提供技术支持，因此我们进行了肠炎沙门氏菌MLST分型方法的研究。 根据国际权威网站www.mlst.net的推荐，选择肠炎沙门氏菌的6个管家基因thrA、purE、sucA、aroC、hemD、dnaN及一个特异性的DNA标记SdfⅠ作为本研究中的目标基因。采用下列引物对上述基因进行扩增：thrA：F5-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3R5-CTCCAGCAGCCCCTCTTTCAG-3;purE：F5-ATGTCTTCCCGCAATAATCC-3R5-TCATAGCGTCCCCCGCGGATC-3;sucA：F5-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3R5-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3;aroC：F5-CCTGGCACCTCGCGCTATAC-3R5-CCACACACGGATCGTGGCG-3;hemD：F5-GAAGCGTTAGTGAGCCGTCTGCG-3R5-ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA-3;dnaN：F5-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3R5-AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC-3;SdfI：F5-TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG-3R5-CGTTCTTCTGGTACTTACGATGAC-3。 在上海生工生物工程技术服务有限公司对PCR产物进行序列测定后，用sequencer2.0软件对测序结果进行分析，用GENbank中鼠伤寒沙门氏菌LT2的thrA、purE、sucA、aroC、hemD、dnaN基因的序列与肠炎沙门氏菌标准菌株及食品中分离出的各个肠炎沙门氏菌菌株相应的序列进行对比，纠正其中可能出现的插入及缺失错误；然后再将各菌株相互比对，找出其中的核苷酸差异。并将各菌株与GENBank中沙门氏菌其它血清型相应的基因序列进行比较。结果显示，在肠炎沙门氏菌的标准菌株和食品中分离的各菌株之间，thrA、purE、sucA、aroC、hemD、dnaN基因PCR产物范围内的核苷酸序列完全相同，即未观察到位于血清型内部的基因突变。而与LT2相比，则每个基因产物均发生了多个点突变。对SdfI的核苷酸序列进行比较研究，在肠炎沙门氏菌的标准菌株50041株、食品中分离的18个菌株SdfI的核苷酸序列与GENBank中该序列的碱基对比，发生了C182T的点突变。即MLST揭示了在同一血清型内部，各菌株之间的管家基因碱基序列高度保守，因此提示了对同一血清型内进行分型，必须使用能够反映多种突变机制的分型方法。 DNA大限制性片段分析是用限制性内切酶在短时间内酶切基因组DNA，这样会产生少量的限制性片段(通常是10～20个)，并根据片段的不同对DNA大分子进行鉴定。然而这些片段通常太大，常规琼脂糖凝胶电泳不能分离，1984年提出的脉冲场凝胶电泳(pulse-neldgelelectrophoresis，PFGE)，通过在凝胶上外加正交的变脉冲电场，使35～10，000kb的DNA分子在凝胶中也能得到有效分离。该法可以快速将来自病人或可疑食品样本的细菌PFGE实验结果进行比较，根据来自同一亲代的个体具有共同的遗传物质，故此可以在PFGE实验中表现出相同的指纹图谱这一原理，确定致病菌的亲缘关系，追溯共同的致病食品的源头所在。本研究选用了经生化反应、血清学及PCR方法鉴定的肠炎沙门氏菌，用营养肉汤增菌后，菌液经离心后包埋于等量的琼脂糖中，并加入模具制成胶块，再用溶菌酶、蛋白酶K处理胶块后，选取寡切点的XbaⅠ、SpeⅠ作为本研究中的限制性内切酶，在短时间内酶切基因组DNA，以产生少量的大限制性片段，并对其进行脉冲场凝胶电泳。为了达到良好的分辨效果，在实验中设置了多种电泳参数，并对其进行优化。最终选定了XbaⅠ酶切后的PFGE电泳参数为1％琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、14℃，6v/cm，120°，4h(25s～65s)，14h(5s～24s)；SpeⅠ酶切后的PFGE电泳参数为：1％琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、14℃，6v/cm，120°，4h(25s～65s)，16h(2s～24s)。结果显示，经XbaⅠ、SpeⅠ酶切电泳后，PFGE方法在肠炎沙门氏菌显示了良好的分辨率，将该结果与国际上有关文献报道中的图谱进行对比，分离效果基本上相似。 经XbaⅠ、SpeⅠ酶切电泳后，肠炎沙门氏菌均分为11个不同的带型。两种内切酶的分型结果不相同，但其中有部分交叉。两种内切酶的PFGE分型都有2个主要的带型，分别涵盖了分离株的70％，并在两型之间有部分兼容性。通过双酶系统的双重分型，还可以将其中的型别进一步区分为亚型。分型结果显示，在各地区之间菌株的型别分布无明显规律，在各种食品之间菌株的型别分布，SpeⅠ酶切后的结果更有规律，此外，分离自羊肉中的4株菌在XbaⅠ、SpeⅠ酶切后的PFGE分型结果中均表现为同一型别，在XbaⅠ分型结果中为XF型，在SpeⅠ分型结果中为SE型，揭示了一定的亲缘关系。