研究背景胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,进展期胃癌的常规治疗效果往往不尽人意,因此人们开始关注胃癌的基因治疗。在基因治疗诸多方法中,自杀基因疗法是目前认为最具临床应用潜力的肿瘤基因治疗策略之一。肿瘤自杀基因疗法要求自杀基因能选择性地在靶细胞中表达,而在正常细胞中不表达,以最大限度地杀伤肿瘤细胞,而不损伤正常组织,满足这一要求的可能方法是利用肿瘤特异性基因调控元件驱动自杀基因表达,如甲胎蛋白基因启动子用于肝癌自杀基因疗法、CMV启动子用于胃癌自杀基因疗法等。现已研究证实,肿瘤血管生成是由血管生成因子及其相应受体调控的,其中血管内皮生长因子VEGF及其受体KDR起着关键作用,VEGF主要通过KDR发挥其促进内皮细胞分裂及血管生成的作用。因此,以KDR启动子驱动自杀基因,可使自杀基因在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性表达,从而达到双重靶向治疗作用。体内外实验表明旁观者效应是自杀基因的独特作用,即不仅转导了自杀基因的细胞可以在给予前药后被杀死,而且与其相邻的未转导自杀基因的细胞亦可被杀死。旁观者效应扩大了自杀基因的杀伤效果,在自杀基因疗法中起着相当重要的作用。至于其确切机制目前尚不完全清楚,故研究其机制将有助于提高自杀基因的治疗作用。基于以往自杀基因治疗的研究,目前仍存在的问题主要有:靶向表达的问题、载体安全性问题以及如何提高杀伤肿瘤细胞的问题等。本研究应用以KDR为启动子的CDglyTK双自杀基因系统进行对胃癌细胞的实验研究,观察双自杀基因系统的靶向杀伤作用及可能的作用机制,为进一步开展靶向治疗胃癌的研究提供实验依据。目的研究腺病毒介导的双自杀基因在KDR启动子调控下对胃癌细胞的体内外靶向杀伤作用及其作用机制,实验内容包括:（1）KDR启动子驱动CDglyTK双自杀基因重组腺病毒的扩增和鉴定,通过293细胞的包装,扩增重组腺病毒,获取一定浓度的含有目的基因的重组腺病毒;（2）通过AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体外实验,观察重组腺病毒对转基因细胞的形态学影响;双自杀基因系统对胃癌细胞的体外靶向杀伤作用;探讨双自杀基因系统是否在体外诱导胃癌细胞的凋亡以及双自杀基因系统的旁观者效应机制的研究;（3）通过AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体内抑制实验,观察该治疗系统的体内抑瘤作用以及是否在体内诱导胃癌细胞的凋亡。方法1.重组腺病毒的扩增和鉴定重组质粒在293细胞中包装成病毒,用293细胞扩增重组腺病毒。当生长良好的293细胞70～80%融合时,感染病毒,待细胞90%以上形成病变时收集细胞冻存,将所有收集的细胞反复冻融4次,离心收集裂解液。应用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。通过荧光显微镜下293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组腺病毒。2.AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体外实验用重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK感染SCG7901、ECV304和HepG2细胞,通过RT-PCR、原位杂交的方法检测目的基因的表达。通过倒置荧光相差显微镜、光镜、透射电镜等技术观察转染基因细胞的形态学变化;通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用MTT法进行生长曲线的测定。在前药5—氟胞嘧啶和/或更昔洛韦不同作用方式下,观察双自杀基因体系的杀伤作用和旁观者效应,并分别通过透射电镜、流式细胞术及Hoechest33258和PI双染观察细胞周期变化及细胞凋亡或坏死。用荧光漂白恢复技术检测转基因和未转基因的SCG7901、ECV304、HepG2、Hela细胞以及芹黄素作用上述细胞的细胞间通讯的功能。同时,取对数期生长的转基因和未转基因的细胞分别按5%:95%和10%:90%两种比例混合,用含或不含芹黄素的培养基,在不同组中分别加入GCV和5-FC混合液,检测细胞存活率。3.AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体内抑制实验采用BALB/C裸鼠,3～4周龄,对数生长期的SCG7901细胞接种于裸鼠右臀区皮下,建立胃癌移植瘤动物模型,当肿瘤直径达0.5cm时,将荷瘤裸鼠随机分为A组（空白对照,不施加任何处理）、B组（注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK与前药5-FC与GCV）、C组（仅注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK）、D组（仅注射前药5-FC与GCV）。治疗后绘制肿瘤生长曲线,观察该治疗体系的体内抑瘤效应;通过RT-PCR、原位杂交方法检测肿瘤组织内融合基因的表达;治疗结束后行瘤体常规病理检查及微血管密度检查,并观察重要脏器心、肝、脾、肺、肾及小肠有无病理变化;用电镜和TUNEL法观察双自杀基因体系作用下荷瘤胃癌裸鼠的肿瘤细胞凋亡。结果1.重组腺病毒的扩增和鉴定pAdEsay-KDRP-CDglyTK经PacⅠ酶切线性化后,以PolyFect Reagent介导转染293细胞,24h后通过荧光显微镜可见GFP荧光表达,3～5d表达达到高峰,7～10d后收集细胞,反复冻融4次。收集上清液再次感染293细胞,大量扩增重组腺病毒。所得病毒纯化后滴度达2×10¹²pfu/ml。PCR鉴定:扩增出2.4kb的CDglyTK基因片断,且未见E₁基因片断扩增。2.AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体外实验2.1重组腺病毒的感染效率采用不同感染复数的重组腺病毒Ad-KDRP-CDglyTK及Ad-CMV-CDglyTK分别感染SCG7901、HepG2和ECV304细胞,96h后观察发现:细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增,当MOI=10时,仅少数细胞有荧光;当MOI=100时,95%以上的GFP表达;MOI=200时,几乎所有的细胞被感染。重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。2.2转基因细胞的形态学及生长特性观察重组腺病毒分别对转基因的SCG7901、HepG2和ECV304细胞的形态无明显影响,而且各种已转基因细胞和未转基因细胞间都具有类似的生长状态。2.3重组腺病毒对各细胞的体外抑制效应以MOI=100的重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK与Ad-CMV-CDglyTK感染各细胞株,加入不同浓度的前药培养,96h后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染腺病毒Ad-CMV-CDglyTK的各细胞对单一前药GCV、5-FC都具有较高的敏感性,感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞对单一前药也具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率各随单一前药GCV、5-FC浓度的增加而递减;而感染腺病毒的Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞对前药不敏感。感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901及ECV304细胞分别在同一浓度前药的作用下,随时间的延长,细胞的存活率逐渐下降,表明同一前药浓度下转基因细胞的存活率与时间存在依赖关系。第七天时,转基因SCG7901细胞在单药GCV、5-FC作用下的细胞生存率分别为（26.92±1.50）%、（31.66±1.25）%,在联合应用前药时细胞存活率为（1.15±1.12）%,三种前药作用下的细胞存活率间有统计学意义（F=477.21,P=0.000）。感染腺病毒Ad-KDR-CDglyTK的HepG2细胞在同一前药浓度下转基因细胞的存活率与时间不存在依赖关系。2.4旁观者效应及联合用药作用效果的检测将感染腺病毒的细胞与未感染的细胞按不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应,并随转基因细胞的比例增加逐渐递增。当转基因细胞的比率为40%时,SCG7901、ECV304和HepG2细胞的生存率分别为（12.47±1.92）%、（9.92±1.40）%和（97.46±1.98）%,三者间生存率得比较有统计学意义（F=2346.67,P=0.000）。转基因SCG7901和同种细胞混合,单一应用GCV时,细胞中转染细胞比例为40%时出现较明显的旁观者效应;仅应用5-FC时,转染细胞比例为5%时即出现旁观者效应,当混合比例大于60%后各组细胞杀伤效果已无显著差异。联合应用前药时,旁观者效应增加,在不同的混合细胞比例下均出现药物协同作用,当混合细胞中转基因细胞比例为40%时,出现显著的协同作用。2.5重组腺病毒对SCG7901、ECV304细胞周期的影响转基因SCG7901及ECV304细胞分别在给以前药处理72h后,流式细胞仪检测结果发现SCG7901和ECV304细胞在S期被阻滞。Pl染色流式细胞仪的亚二倍峰数值,在SCG7901、ECV304和HepG2各自细胞对照组的凋亡率为（2.01±0.32）%、（1.62±0.49）%和（1.56±0.16）%,各自细胞治疗组的凋亡率分别为（29.25±4.85）%、（27.37±4.16）%和（1.34±0.34）%,结果显示SCG7901、ECV304各自细胞的对照组和治疗组的细胞凋亡率间有统计学意义,而HepG2细胞在对照组和治疗组的细胞凋亡率间无统计学意义。2.6前药处理后SCG7901及ECV304细胞的电镜观察电镜下见部分细胞体收缩、染色质边聚,有者胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片,有者可见凋亡小体、（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。2.7 Hoechest33258和PI双染根据活细胞呈弱蓝色及弱红色荧光,凋亡细胞呈蓝色及弱红色荧光,死细胞呈强红色及弱蓝色荧光来分析各组细胞的凋亡情况:A组:SCG7901/CDglyTK+前药为（30.18±5.63）%;B组:ECV304/CDglyTK+前药为（26.39±4.40）%;C组:HepG2/CDglyTK+前药为（1.71±0.91）%;D组:SCG7901/CDglyTK+不加前药为（1.34±0.72）%;E组CG7901+药物为（1.60±0.83）%,各组之间的差异有统计学意义（F=201.35 P=0.000）。2.8 FRAP检测SCG7901、ECV304、HepG2、Hela各个细胞的细胞间通讯功能光淬灭恢复技术结合共聚焦显微镜观察到淬灭后的SCG7901、ECV304、HepG2细胞的荧光强度明显降低,随后随时间的推移,被淬灭细胞的荧光强度在逐渐恢复;而淬灭后的Hela细胞荧光强度明显降低,随时间的推移荧光强度无明显恢复,各组细胞之间荧光恢复率的差异有统计学意义（F=5.97 P=0.006）。2.9上调剂作用下上述各个细胞的细胞间通讯功能的检测图像中观察到在芹黄素的作用下SCG7901、ECV304、HepG2细胞淬灭后荧光强度明显降低,随后随着时间的推移,被淬灭细胞的荧光强度在逐渐恢复,在相同时间内其恢复强度较未应用上调剂的同种细胞要强;而在芹黄素作用下的Hela细胞被淬灭后荧光强度明显降低,随时间的推移荧光强度无明显恢复,在上调剂芹黄素作用下的各种细胞之间的荧光恢复率的差异有统计学意义（F=55.80 P=0.000）。2.10“旁观者效应”的检测及芹黄素对其的影响将重组腺病毒感染的SCG7901、ECV304、HepG2、Hela细胞分别与未感染的同种细胞以5%和95%、10%和90%比例混合培养,观察到该体系的旁观者效应。转基因细胞比例占5%时,SCG7901、ECV304分别在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组中细胞生存率有差异（F=152.32 P=0.000）、（F=218.78 P=0.000）;转基因细胞比例占10%时,SCG7901、ECV304分别在上述四组中的生存率有差异（F=407.83P=0.000）、（F=523.67 P=0.000）。3.AdKDR-CDglyTK双自杀基因系统的体内抑制实验3.1荷瘤裸鼠肿瘤生长情况接种肿瘤细胞后13d左右,裸鼠出现右臀区皮下瘤结节。裸鼠成瘤达0.5cm后开始治疗,绘制肿瘤的生长曲线,治疗结束时肿瘤标本的称重结果及抑瘤率:A组:（501.94±4.50）mg;B组:（25.04±3.09）mg,抑瘤率为79.01%;C组:（503.79±6.27）mg;D组:（498.07±4.46）mg,治疗结束后A、B、C、D组间瘤重有统计学意义（F=12727.42 P=0.000）,B组明显缩小,A、C组与D组间肿瘤生长情况无统计学意义。3.2肿瘤病理变化所有的动物皮下移植瘤为圆形、椭圆形或不规则的结节状,活动度较差。选取CD34单克隆抗体以免疫组化观察肿瘤组织MVD,发现A、B、C、D组中MVD值分别为（29.46±6.33）、（6.05±1.30）、（27.9±6.21）、（28.77±3.85）,结果显示,四组间MVD值异有统计学意义（F=27.04 P=0.000）。3.3治疗后裸鼠重要脏器的组织学观察为了解该治疗系统对裸鼠有无毒副作用,取治疗组小裸鼠心、肝、肺、肾及小肠组织行常规病理检查未见明显异常。3.4 TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率光镜下观察到凋亡细胞散在分布于肿瘤组织中,可见到凋亡小体。A、B、C、D组凋亡指数分别为（1.94±0.53）%、35.76±5.88)%、（2.02±0.60）%、（1.70±0.73）%,说明四组间凋亡指数差异有统计学意义（F=160.02 P=0.000）,B组分别与A、C、D三组间凋亡指数的比较有统计学意义。KDR启动子驱动双自杀基因体系能够诱导胃癌细胞的凋亡。结论1.对融合基因的重组腺病毒进行包装与扩增、纯化与鉴定,制备了高纯度、高滴度的含目的基因的重组腺病毒;2.携带目的基因的重组腺病毒对SCG7901、ECV304、HepG2细胞的形态及生长特性方面无影响;3.Ad-KDR-CDglyTK双自杀基因可在体外靶向杀伤SCG7901、ECV304细胞。联合给药可产生明显的协同作用;4.首次观察到Ad-KDR-CDglyTK双自杀基因体系在SCG7901、ECV304细胞中存在旁观者效应;并可在体外诱导SCG7901、ECV304细胞的凋亡;5.首次应用FRAP技术证实SCG7901、ECV304、HepG2细胞间通讯功能与缝隙连接有一定关系,而Hela细胞不存在细胞间通讯功能。上调剂可以扩大SCG7901细胞的旁杀效应;6.首次观察到双自杀基因系统在SCG7901细胞中的旁观者效应机制可能与细胞间的缝隙连接、细胞凋亡有一定关系;7.应用SCG7901可成功建立胃癌移植瘤裸鼠普通动物模型,将为研究人胃癌治疗实验提供可靠的研究工具;8.重组腺病毒转基因荷瘤动物肿瘤组织内可检测到CDglyTK融合基因产物的表达,该治疗体系具有较满意的体内抑瘤作用,表现为肿瘤的生长抑制、瘤体微血管密度减少等;9.双自杀基因系统可以在体内诱导荷瘤胃癌裸鼠肿瘤细胞的凋亡;10.双自杀基因系统治疗后,荷瘤胃癌裸鼠心、肺、脾、肝、肾、小肠等器官无明显组织病理学变化,提示该系统对荷瘤裸鼠无系统毒副作用。