CRISPR/Cas9技术在2013年初以其易用性和高效性迅速成为基因组编辑领域的关注热点。其原理是:在包含20碱基靶点序列的引导RNA的引导下,Cas9核酸酶可以对靶位点进行识别和切割,形成DNA双链断裂结构,从而激活细胞内的两种修复机制,即非同源末端连接或同源重组,通过这两种修复机制引发断口处碱基的丢失、插入和替换,获得突变体。为了助力于CRISPR/Cas9系统在植物中的广泛应用,本研究首先建立了适用于单子叶及双子叶植物的CRISPR/Cas9工具箱,接着在玉米原生质体、转基因株系及拟南芥转基因株系中对这些工具进行了验证。为了建立可用于单子叶和双子叶植物基因组编辑的CRISPR/Cas9工具箱,本研究采用了以玉米密码子的偏好性优化的SpCas9合成基因,合成的Cas9基因两端各加入了一个核定位信号。为了高效表达Cas9,本研究使用了在植物中常用的组成性高表达启动子,即在单子叶植物中使用玉米Ubi1启动子,在双子叶植物中采用2×35S启动子。为了表达sgRNA,本研究在单子叶植物中采用了水稻U3基因,小麦U3基因和拟南芥U6基因的启动子,在双子叶植物中采用了 3个拟南芥U6基因的启动子。为了适用瞬时及稳定表达CRISRP/Cas9系统,采用了两种双元载体支架,即pGreen和pCambia类双元载体支架。此外,为了适用不同的植物品种,采用了 3种植物抗性筛选标记基因。本研究基于Golden Gate和Gibson Assembly策略建立了只需一步反应便可获得植物CRISPR/Cas9双元载体的方法。获得的双元载体可以含有一个,也可以含有多个sgRNA表达框。本研究首先在玉米原生质体中对3种Cas9基因变体诱导靶基因突变的效率进行了比较,3种Cas9基因变体包括玉米密码子优化的Cas9和两种人源密码子优化的Cas9,发现玉米密码子优化的Cas9的确可以更高频率的诱导基因组编辑。本研究也比较了当使用分别来自小麦U3,水稻U3和拟南芥U6-26基因的3种PolⅢ启动子时,在玉米原生质体中诱导靶基因突变的效率,结果显示使用3种启动子均可以高效诱导靶基因突变。为了验证此CRISPR/Cas9工具在创制植物突变体中的应用潜力,本研究选择了参与拟南芥表皮毛发育的三个基因TRY、CPC及ETC2作为报告基因,结果表明,T1拟南芥发生基因组编辑的效率超过了 90%。通过表型观察和靶基因突变分析发现,得到的T1代拟南芥突变体全部为严重的嵌合体,通过检测与转基因成分分离产生的非转基因突变体发现,突变传代的效率也较低。我们转而利用卵细胞特异性启动子表达CRISPR/Cas9策略。结果表明,用卵细胞特异性启动子策略成功的解决了拟南芥T1代突变体严重嵌合的问题,同时发现适合的终止子也至关重要。为了进一步提高效率,本研究测试了几个卵细胞特异性启动子融合的策略,发现EC1.2en-EC1.1p融合启动子驱动Cas9大幅提高了 T1代获得纯合或双等位突变体的效率,由原来的8.3%提高到24.7%,其效率是原效率的将近3倍。在检测使用EC1.2en-EC1.1p融合启动子得到的15个T1代突变体时,本研究意外发现了 CRISPR/Cas9系统在拟南芥中存在高频的脱靶现象:在T1代15个突变体,20%(3/15)和高达87%(13/15)的株系分别在TRY和CPC基因发生了脱靶突变。为了克服脱靶效应,本研究测试了 6种高特异性Cas9突变体,包括eSpCas9、SpCas9-HF1及其二者的组合。结果发现,尽管在T1代效率很低,但在T2代,eSpCas9(1.1)具有与野生型SpCas9相当的突变效率。这些结果提示,eSpCas9(1.1)发挥高效作用时依赖于其表达量。分析脱靶突变发现,高特异性Cas9的脱靶率在可检测水平以下。在分析靶基因突变时,我们也意外发现另一个有趣的现象,即T-DNA高频率插入CRISPR/Cas9诱导的靶基因切割点中。综上所述,本研究建立了一套高效应用于单子叶和双子叶植物的CRISPR/Cas9基因组编辑工具箱,为植物基因功能的研究提供了有用的工具。