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目的:雪旺细胞在周围神经损伤后的Wallerian溃变中发挥着重要作用,参与了Wallerian溃变的整个过程。在Wallerian溃变过程中,雪旺细胞会在不同的时期发生增殖、凋亡,同时经历了一系列基因表达的变化,影响着周围神经再生的命运。但这些基因调节雪旺细胞增殖和凋亡的内在机制仍不清楚。本课题组前期的研究结果表明,分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)和蛋白激酶Cα(protein kinase c alpha,PKCα)在大鼠坐骨神经损伤后均表达上调,同时上调的SPP1能够促进雪旺细胞增殖,抑制雪旺细胞凋亡;上调的PKCα也能够促进雪旺细胞增殖。已有文献报道SPP1能够促进PKCα的表达,那么SPP1是否通过PKCα影响雪旺细胞增殖和凋亡,SPP1作为分泌型糖蛋白又是如何影响胞内激酶PKCα等问题均不明确。既往研究指出SPP1能够与多种细胞的膜表面受体CD44和αvβ3结合影响胞内信号通路,其中包括PKCα及下游信号分子。但受体CD44和αvβ3是否参与了周围神经损伤后SPP1调节雪旺细胞增殖和凋亡的功能,以及是否将信号从SPP1传递给PKCα也并不清楚。PKCα可以通过ERK促进细胞增殖,通过Bcl-2抑制细胞凋亡,但在雪旺细胞中SPP1通过PKCα促进雪旺细胞增殖、抑制雪旺细胞凋亡是否也与上述信号通路相关都需要进一步探讨。因此,本研究的主要目的是探究SPP1是否可以通过PKCα发挥作用;明确受体CD44和αvβ3是否参与SPP1对PKCα的调节;揭示SPP1/PKCα分别调节雪旺细胞增殖与凋亡的信号通路,以期为临床上周围神经损伤修复的干预提供可靠的分子靶点。方法:1.收集患者外伤后损伤的正中神经远端组织。2.利用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色技术检测SPP1、PKCα在人周围神经损伤后表达的变化及定位。3.培养原代雪旺细胞,通过siRNA干扰SPP1同时PMA激活PKCα,或者质粒过表达SPP1同时利用Go6976抑制PKCα,探究SPP1和PKCα之间的关系,及对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,具体包括:利用EdU和流式细胞技术等检测对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,利用Western blot检测下游p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3 表达情况。4.建立大鼠坐骨神经损伤模型,通过RT-qPCR、Western blot检测细胞表面蛋白CD44和αvβ3在神经损伤后表达的变化趋势,利用免疫荧光染色检测其在大鼠坐骨神经和原代雪旺细胞中定位。5.在原代雪旺细胞中,通过siRNA分别沉默CD44和β3,利用EdU和流式细胞技术等检测其对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,利用Western blot检测下游p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3 表达情况。6.利用外源性SPP1(rOPN)模拟分泌型SPP1,与CD44、β3的siRNAs相结合,进一步探究SPP1对雪旺细胞增殖和凋亡发挥作用的信号通路。结果:1.患者正中神经损伤远端组织中,SPP1和PKCα均定位于雪旺细胞中,且在神经损伤后表达呈上调趋势。2.和SPP1一样,PKCα能够抑制雪旺细胞凋亡,促进雪旺细胞增殖;同时与SPP1均能上调ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达水平,抑制Caspase-3活化,且SPP1可以通过激活PKCα调节上述细胞因子,进而促进雪旺细胞增殖和抑制其凋亡。3.CD44和αvβ3均在大鼠坐骨神经雪旺细胞中定位,且周围神经损伤后表达增加。同时CD44主要表达于原代雪旺细胞的细胞膜上,而αvβ3表达于细胞膜表面的黏着斑上。4.在原代雪旺细胞中CD44和αvβ3均能够抑制凋亡、促进增殖,分别用siRNA沉默两者后发现雪旺细胞中p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax相对表达下调,cleaved Caspase-3/Caspase-3 相对表达上调。5.与过表达内源性SPP1类似,加入外源性SPP1(rOPN)也可以上调雪旺细胞中PKCα的表达,同时上调ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达,抑制Caspase-3活化。6.siRNAs 分别沉默 CD44 或 β3 后,PKCα 表达、ERK 磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达下调,Caspase-3被活化。在CD44或β3被沉默的背景下加入rOPN,rOPN无法发挥上调雪旺细胞中PKCα、ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达、抑制Caspase-3活化的作用。SPP1促进PKCα及下游信号通路的作用被si-CD44或si-β3 所阻断,说明 CD44 和 β3 均参与 SPP1-PKCα 对雪旺细胞增殖的促进和凋亡的抑制作用。结论:我们通过对可能参与SPP1在周围神经损伤后Wallerian溃变过程中促进雪旺细胞增殖、抑制雪旺细胞凋亡的分子机制的研究,得出如下结论:1.临床患者周围神经损伤后,雪旺细胞中SPP1和PKCα表达明显增加。2.SPP1通过细胞膜上CD44和αvβ3,激活PKCα及下游信号通路促进雪旺细胞增殖,抑制细胞凋亡。3.SPP1通过PKCα-ERK通路促进雪旺细胞增殖。4.SPP1 通过调节 PKCα-Bcl2/Bax-cleaved Caspase-3/Caspase-3 介导雪旺细胞的抗凋亡作用。