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地球上大约存在着350000种被子植物,如何研究这些被子植物的演化规律并对物种进行合理的划分及归类是植物学家和进化生物学家最为关心的科学问题。花作为被子植物最重要的有性生殖器官,由于拥有相似的结构特征和多样的形态变异而成为植物学和进化生物学研究的热点和重点。大部分的被子植物都具有典型的萼片、花瓣、雄蕊和心皮结构。其中雄蕊和心皮是被子植物形态相对保守的器官,而萼片和花瓣的颜色和形态都具有丰富的变异,这一特点尤其在基部被子植物、单子叶植物和基部真双子叶植物中多见。已有的功能基因研究显示MADS-box等基因参与了植物花器官的建成,在结合了大量的系统学分析后发现,被子植物在基部真双子叶植物过渡到核心真双子叶植物时,MADS-box基因业家族均发生了基因复制事件。那么复制之前的MADS-box基因的功能是什么,其演化模式及如何控制古老双子叶植物中花器官的形态多样性?否同样具有类似模式物种中的功能,是否花部的形态多样性也与这些基因相关息息相关?本文以基部真双子叶植物箭叶淫羊藿作为实验材料,着重对以下几个方面进行研究和讨论。
1.花发育相关基因的克隆
我们应用RACE技术并结合EST数据库,从箭叶淫羊藿的中克隆到了十二个与花发育相关的基因,他们包括:一个A类基因EsFUL、四个B类基因EsAP3-1、EsAP3-2、EsAP3-3及EsPI、两个C/D类基因EsAG和EsAG11、两个E类基因EsAGL2-1和EsAGL2-2、一个AGL6-like基因EsAGL6、一个TM3基因EsSOC-like和一个SVP/AGL24基因EsSVP-like。同时我们还克隆到了两个和进化发育关键基因:一个是YABBY基因家族的EsCRC基因和一个MYB基因家族的EsMIXTA基因。
2.A类、E类及AGL6类基因的功能及A/E协同进化研究
对A类、E类及AGL6类这三个在MADS-box基因家族中亲缘关系相对较近的三个业家族进行表达、功能及蛋白互作研究,结果显示A类基因在发育着的各个器官中都有所表达,EsAGL2-1在除了根中的所有器官中都表达,而EsAGL2-2则只在花器官中表达。相比这三个基因,EsAGL6的表达范围更加狭窄,只在花部器官中有所表达。通过转基因实验证明EsFUL基因通过调节AP1基因的上调从而参与着开花时间的建成,即促进花分生组织的形成。同时我们发现EsAGL2-1和EsAGL6基因的超表达并不对野生型拟南芥造成任何影响。通过蛋白互作研究发现EsAGL6基因具有和E类基因相似的互作伙伴,这同矮牵牛中的AGL6类基因的互作伙伴类似,从而证明了这类基因进化过程中蛋白互作的保守性。同时我们发现了EsAGL2-2基因C末端的蛋白自激活能力,并且发现了它和EsAGL2-1蛋白之间的互作差异,从而证明了二者在功能上的分化。同时,为了深入分析A类基因和E类基因的协同进化关系,我们通过对A类基因在不同物种中两侧的共线性基因对比分析发现,A类基因和E类基因是紧密连锁的,很有可能是由于这种紧密的连锁关系导致了在基因组发生了复制之后,这两类基因的各种旁系同源基因并没有丢失从而呈现出协同进化的关系。
3.箭叶淫羊藿的花发育C/D类基因和EsCRC基因的序列结构和表达分析
通过转基因实验发现EsAG基因具有C类基因保守的功能,即调控心皮发育。EsCRC可以互补crc-1突变体表型,证明该基因则由于在进化过程中表达位置的不同除了参与心皮的发育,同时应召到了萼片发育过程。通过蛋白互作研究发现EsAG和EsAG11通过和不同的互作伙伴发生相互作用从而两类基因发生了功能上的分化。通过表达分析发现,EsAG基因和EsAG11基因在表达模式上存在着一定的差异,同时这种差异也表现在蛋白互作伙伴上的不同。通过这些数据可以得出EsAG和EsAG11之间已经产生了一定的亚功能化或者新功能化。转基因结果发现.35S::EsAG可以使野生型拟南芥的萼片转变为心皮状,这证明AG基因在进化过程中一直保持了其保守的功能。同时我们还阐述了另外一个和心皮发育相关的基因EsCRC。通过实时定量PCR结果显示,在箭叶淫羊藿和黔岭淫羊藿中其只在萼片和心皮中表达。但是突变体互补试验结果显示EsCRC基因依然可以互补拟南芥的突变体表型,这证明可能是由于表达层面上的改变导致了EsCRC基因应召到了萼片和心皮的发育,而基因本身并没有丢失功能。
4.花瓣状器官形成相关的B类基因和MIXTA基因的对花瓣状器官形成的影响
通过序列结构及系统发育重建发现EsAP3-1、EsAP3-2和EsAP3-3分别属于发生在毛莨目的AP3类基因进化复制的三个分支(AP3-Ⅰ、AP3-Ⅱ及AP3-Ⅲ)。通过表达分析发现EsAP3-1、EsAP3-2及EsPI具有较广泛的表达模式,如不仅他们在萼片中的外延表达很有可能是导致花瓣状萼片形成的直接原因,而EsAP3-3基因则只限制在花瓣中表达,此基因很有可能是AP3类基因在发生复制后业功能化或新功能化的表现。蛋白互作实验发现基部真双子叶植物箭叶淫羊藿在单子叶植物和核心真双子叶植物的过渡类型既可以形成同源二聚体又可以形成异源二聚体,这种多样的互作模式很有可能是过渡植物类群中的互作模式表现,也有可能是由于基因本身M区域删除所带来的互作模式的改变。MIXTA基因的表达分析结果显示,该基因可能参与了花瓣状萼片细胞突起这一形态建成,但后续还需要更多的转基因实验进行验证。