研究背景甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein, PTHrP)最初是从与高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出的一种多肽类物质,PTHrP的活性位置位于1-34的氨基酸肽段,而成熟有活性的分泌形式为PTHrP (1-36), PTHrP起作用的形式有内分泌、旁分泌和自分泌三种,主要为旁分泌形式,PTHrP自发现以来目前确定的内分泌功能有三个,分别为：肿瘤来源导致骨吸收继发高钙血症,促进正常乳腺泌乳,在胚胎时期维持胎盘钙代谢平衡。PTHrP与甲状旁腺激素(Parathyroid hormone, PTH)有着相似的结构,PTHrP与其受体PTHR广泛存在于体内多种正常组织器官,参与血管生成、骨形成、乳腺发育等多种生理过程,但在不同种属、不同组织中PTHrP可能与不同受体结合,产生不同的效应。多年来PTHrP的研究大多关于骨骼和肿瘤方面,并已有多年的实验和临床研究证实其具有促进骨质形成的作用,临床上有应用PTHrP促进骨质合成治疗骨质疏松症,取得了良好的治疗效果,为一种起效快、副作用少的骨形成促进剂。但另一方面有个别研究显示PTHrP可促进肾小管上皮细胞的分化,从而促进肾纤维化的发生,且此作用与TGF-β1(transforming growth factor-β1),EGF (endothelial growth factor)以及VEGF (vascular endothelial growth factor)等细胞因子密切相关。TGF-β1是很强的促纤维因子,在各种纤维化过程中处于中心地位,包括肝纤维化,但关于PTHrP在肝脏中的作用尚未有系统的研究。肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝病进展中由于肝内纤维生成与降解失衡,导致过多的胶原在肝内沉积,常伴发于慢性炎症并可进一步发展为肝硬化、肝癌。促进肝纤维化形成的细胞有：肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)、 Kuffer细胞、肝门成纤维细胞等间质细胞,而肝星状细胞是主要的胶原纤维来源。在肝脏损害过程中,一般认为是凋亡的肝细胞会释放ROS (reactive oxygen species)和一些炎症趋化因子,使淋巴细胞和巨噬细胞聚集,上述的炎症细胞会分泌可溶性的细胞因子如TGF-β1、TNF-α (tumor necrosis factorα)、FGF (fibroblast growth factor)等,这些细胞因子可将HSCs激活为肌成纤维样细胞(myfibroblasts)。HSCs的活化是肝纤维化形成的中心环节,现有的关于HSCs的两个活化假说,其共同点是激活后该细胞本身可分泌更多的上述促进纤维化的细胞因子,并产生胶原、蛋白聚糖等,使细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量堆积,导致肝纤维化的发生。而在HSCs的多种活化刺激物中TGF-β1处于中心地位,是最强的促纤维生成因子,其可活化HSCs并诱导胶原合成,而活化的HSCs自身也会分泌TGF-β1,形成一个正反馈环路。当HSCs活化后,其强烈表达a-SMA (alpha-smooth muscle actin),此因子为成纤维细胞标记物,为HSCs活化的标志；另活化的HSCs还大量合成作为ECM主要组成成分的胶原蛋白(collagen)和胶原降解酶如金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等,这些因子主要来源于HSCs。此过程的持续使得胶原沉积和肝功能损伤最终导致肝纤维化。PTHrP在正常肝脏中有表达,而早在1993年就有报道内毒素血症时肝细胞内PTHrP表达明显增高并且PTHrP可引起肝内细胞的急性炎症损伤,上述结果表明PTHrP在肝脏疾病发生发展中可起细胞因子的作用。内毒素血症对于肝脏的作用早在1975年就已有报道,现今内毒素在急慢性肝损伤中起重要作用的观点已被广泛接受,且其存在还与肝病的严重程度相关,但内毒素血症状态下PTHrP起何种作用尚未见报道,值得我们关注。随后有研究对肝硬化患者血中PTHrP (1-84)浓度的测定发现与正常人相比没有明显的增高,并且与病变的严重程度亦没有相关性。但已有的体内研究和我们前期研究均证实PTHrP在正常机体血循环中表达量非常低,甚至低于检测标准的下限。现已知PTHrP起作用可通过内分泌、旁分泌和自分泌三种模式,而最主要的是旁分泌途径,因此尽管肝硬化患者血中PTHrP无明显增高,亦不能排除其通过旁分泌或自分泌的途径影响肝脏内的其他细胞,因此PTHrP在肝内分泌及作用非常值得进一步的研究。现有的治疗骨质疏松的药物主要包括拮抗骨吸收剂和刺激骨形成剂两大类,但对慢性肝病导致的骨质疏松疗效欠佳,PTHrP的出现为我们提供了一个新的选择,但PTHrP作为一种前景良好的骨形成促进剂,却具有促肾纤维化的作用,而且对肝脏的影响作用尚不明确；且慢性肝病内毒素血症时肝细胞中PTHrP明显升高并可造成肝细胞的急性损伤,但具体机制尚不明确,而国内外均未见PTHrP对肝内各细胞影响的系统性研究。PTHrP作为治疗骨质疏松的药物用于人体,其对正常人或患有慢性肝病的患者影响如何亦未见报道,因此PTHrP对于肝脏的影响非常值得进一步的探讨。研究目的和意义肝星状细胞的活化一直是肝纤维化研究中的热点,因此PTHrP对肝星状细胞的影响作用给我们提供了一个新的研究切入点,可为PTHrP作为治疗手段提供药理学依据,亦可揭示PTHrP引起肝内细胞的急慢性损伤的病理机制。材料和方法1、商业购买人肝星状细胞两株,分别为人肝星状细胞的正常细胞株HSC和其活化株LX-2,分别予以不同浓度的PTHrP(1-36)(0.1nM、1nM、10nM、100nM)处理不同时间段(6h、12h、24h、48h),后收集细胞总蛋白、总RNA及其细胞培养上清液；2、运用相对定量逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-qPCR)及蛋白质印迹方法(Western-blot)分别从基因水平及蛋白水平检测上述处理后细胞产物的活化相关因子(a-SMA.MMP-2.collagen I.TGF-β1)；3、运用细胞免疫荧光方法(Immunofluorescence)检测PTHrP(1-36)(100nM,48h)处理后HSC和LX-2中a-SMA表达情况；4、运用酶联免疫吸附剂测定方法(ELISA)检测PTHrP(1-36)(10-100nM,24-48h)处理后HSC培养上清液中TGF-p1浓度变化(单位pg/ml)；5、统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,各组间差异比较采用多样本均数比较方差分析(ONEWAY-ANOVA),结果以均数±标准差的方式表示,其中RT-qPCR结果对照组统一量化为1,Western-blot结果对照组统一量化为100,所有统计结果以P<0.05为具有显著性差异。研究结果1、我们从基因和蛋白两个水平检测了PTHrP(1-36)处理的两种细胞中α-SMA. collagen I(Ⅰ型胶原)、MMP-2(金属蛋白酶-2)三个与肝星状细胞活化密切相关的因子,发现两种细胞在浓度10-100nM处理24-48h的条件下α-SMA呈现2-3倍的上调趋势(P<0.05)；10-100nM处理24-48h的条件下两种细胞的MMP-2基因和蛋白水平呈现2-3倍的上调趋势(P<0.05)；HSC在10-100nM处理24-48h的条件下Ⅰ型胶原的基因和蛋白水平呈现约2倍的上调趋势(P<0.05),而LX-2仅在100nM处理24-48h的条件下出现Ⅰ型胶原基因和蛋白水平的上调(P<0.05)。2、运用细胞免疫荧光方法检测PTHrP(1-36)处理后两种细胞,发现正常HSC对照组荧光基本缺如,而处理组与对照组相比出现活化标志蛋白α-SMA的表达明显增高,在LX-2细胞亦观察到处理组比对照组稍升高。3、HSC经PTHrP(1-36)处理后,出现TGF-β1的合成和分泌增高,在10-100nM处理24小时后可检测到差异,其中在100nM PTHrP处理48h后,TGF-β1的基因和蛋白的相对表达量分别为2.963±0.337和356.608±6.587,它们的差异均有统计学意义(P<0.05)；但LX-2需在浓度100nM处理48h后才具有明显差异。而HSC细胞培养上清液中的总TGF-β1为513.6425±82.9245pg/ml,其对照组则为190.0733±11.642pg/ml,两者比较存在显著性差异(P<0.05)。主要结论1、对于正常的人肝星状细胞HSC,PTHrP(1-36)处理后可快速引起该细胞的活化标志蛋白α-SMA的强烈表达,以及collagen Ⅰ、MMP-2的表达增加,并诱导强促纤因子TGF-β1的合成和分泌,而上述效应在PTHrP(1-36)浓度为10nM作用时间为24h后即可检测到,上述结果表明PTHrP(1-36)对正常人肝星状细胞具有活化作用。2、对于已活化的人肝星状细胞株LX-2,PTHrP(1-36)亦可引起α-SMA. collagen Ⅰ、MMP-2和TGF-β1的表达增加,其中α-SMA、MMP-2和TGF-β1的增多在PTHrP(1-36)浓度为10nM作用时间为24h后可检测到,而collagenⅠ则在PTHrP(1-36)浓度为100nM作用时间为24h后方可检测到,上述结果表明PTHrP(1-36)可使已活化的星状细胞合成更多的促纤因子,但胶原的增加可能需要更高的浓度和更长时间。3、PTHrP(1-36)可引起正常人肝星状细胞的活化,以及促使已活化的星状细胞合成更多的促纤因子,在两种细胞中都可检测到TGF-β1的合成和分泌增加,TGF-β1是强力的促纤因子,因此PTHrP(1-36)影响人肝星状细胞的其中-个途径,可能是通过影响TGF-β1而激活下游的相关信号通路。