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山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶,具有活血化瘀,理气通脉,化浊降脂之功效。其提取物是山楂叶经50%乙醇提取后过D101大孔树脂洗脱得到的部位,始收录于2010版《中国药典》。目前,《中国药典》山楂叶提取物项下仅测定了牡荆素鼠李糖苷的含量以及牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷4种黄酮化合物的特征图谱,并未对其他3种成分进行含量测定。黄酮类化合物是山楂叶的主要活性成分,对活性成分的含量及其在体内血药浓度的测定有利于临床合理用药和疗效控制。本研究建立了快速、准确的HPLC一测多评法用于山楂叶提取物中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的含量测定;建立了4种黄酮化合物的生物样品UPLC-MS/MS分析方法,对4种黄酮类单体经静脉给药后在大鼠血浆中的含量变化以及山楂叶提取物经口服给药后4种黄酮类成分在大鼠血浆中的量变行为进行了研究。第一部分一测多评法测定山楂叶提取物4种黄酮类成分的含量目的:建立同时测定山楂叶提取物牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷4种黄酮类成分含量的一测多评法,提高山楂叶提取物的质量标准。方法:采用ZORBAX SB-C18（250×4.6 mm,5μm）色谱柱,0.6%乙酸水-乙腈-四氢呋喃进行梯度洗脱,柱温30℃,进样量10μL,流速1.0 mL/min,检测波长350 nm。以牡荆素葡萄糖苷为内参物,计算牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷的相对校正因子（RCF）,建立同时测定4种黄酮化合物含量的一测多评法。采用相对误差法将一测多评法的结果与传统外标法进行比较,考察一测多评法的准确度。结果:山楂叶提取物经HPLC系统分离,各目标成分分离度良好（R>1.5）,方法学考察符合定量分析的要求。以牡荆素葡萄糖苷为内参物,牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的RCF分别为0.963、1.116、1.034,RCF在不同色谱柱、不同色谱仪和不同实验室下的RSD范围为0.34%至1.92%,相对校正因子的耐用性良好。牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷的相对保留值分别为0.518、0.864和0.957,不同仪器和不同色谱柱下相对保留值的RSD范围为0.11%至1.89%,色谱峰定位准确。一测多评法和外标法的含量测定结果的相对误差RE<5.0%,一测多评法的准确度良好。10批山楂叶提取物中4种黄酮类成分的平均含量分别为牡荆素葡萄糖苷2.5%、牡荆素鼠李糖苷12.0%、牡荆素0.2%、金丝桃苷0.07%。结论:本部分建立的一测多评法简单、准确,适用于山楂叶提取物中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷4种黄酮化合物含量的同时测定,可为提高山楂叶提取物质量标准提供依据。同时,牡荆素鼠李糖苷的含量符合现行2015版《中国药典》的限量要求（≥8.8%）,可为后续药代动力学研究提供依据。第二部分UPLC-MS/MS法测定4种黄酮类成分分别经静脉给药后在大鼠血浆中的含量及其药代动力学研究目的:建立测定血浆样品中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷的UPLC-MS/MS分析方法,验证方法适用性,比较以上4种黄酮类成分分别经静脉注射给药后含量变化,探讨其药代动力学特征,为山楂叶提取物中黄酮类成分的开发和设计合理给药方案提供科学依据。方法:Wister大鼠24只,随机分成牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷4个单体静脉注射组,分别按2.5 mg/kg、5 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg尾静脉注射给药,于给药前后0至24 h从眼眶取血,并用乙腈沉淀蛋白。在Waters ACQUITY-AB SCIEX QTRAP 5500系统下,以黄芩苷（200 ng/mL）作为内标,0.02%甲酸水（含2 mmol/L甲酸铵）和乙腈梯度洗脱,多反应监测负离子模式进行检测。按照2015版《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则进行方法学考察。DAS 3.0软件对血药浓度-时间数据进行非房室模型统计矩计算,以获得各个目标成分的药代动力学参数。结果:在各离子通道中目标成分和内标物的保留时间附近无明显内源性物质干扰,方法专属性良好。4种黄酮化合物在大鼠血浆中的线性范围分别为牡荆素葡萄糖苷10～10000 ng/mL、牡荆素鼠李糖苷10～15000 ng/mL、牡荆素6～6000 ng/mL、金丝桃苷4～3600 ng/mL,日内和日间精密度的RSD≤13.61%,准确度RE在-5.70%～3.79%之间,提取回收率在75.27%～91.97%之间。单体静脉注射牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷活性单体后,2 min即可检测到原型药物,半衰期t1/2分别在1.20±0.66 h、1.17±0.41 h、1.59±0.34 h、0.20±0.13 h,4种黄酮化合物均消除迅速,其中金丝桃苷消除最快。4种黄酮类成分的平均驻留时间MRT为3.73 h、1.45 h、1.36 h、1.25 h,牡荆素入血10 h后检测不到,其它在24 h仍能检测到。此外,金丝桃苷的表观分布容积Vz较其它3种成分大（4.60L/kg）,说明主要分布于组织中。结论:本部分建立的UPLC-MS/MS分析方法具有特异性和高灵敏度,所有方法学考察均符合生物样品测定的要求。此方法对牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷4种黄酮化合物在血浆样品中的含量测定具有普适性,成功地用于4种黄酮化合物各自静脉入血后的药代动力学行为表征。此外,通过比较4种黄酮类成分的主要药代动力学参数发现,4种黄酮类成分均消除迅速,金丝桃苷消除最快。第三部分UPLC-MS/MS法同时测定山楂叶提取物经口服给药后4种黄酮类成分在大鼠血浆中的含量及其药代动力学研究目的:建立同时测定血浆样品中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷4种黄酮类成分的UPLC-MS/MS分析方法,比较以上4种黄酮类成分在山楂叶提取物经大鼠口服给药后的量变行为,探讨其药代动力学特征,为评价山楂叶提取物活性成分入血情况以及解释其作用机制提供依据。方法:Wister大鼠6只,按1 g/kg的剂量口服给予山楂叶提取物,于给药前后024 h从眼眶取血。血浆样品经过乙腈沉淀蛋白-氮气吹干（50℃）-初始流动相复溶的方法进行预处理,于Waters ACQUITY-AB SCIEX QTRAP 5500系统下,以黄芩苷（100 ng/mL）作为内标,0.02%甲酸水（含2 mmol/L甲酸铵）和乙腈梯度洗脱,多反应监测负离子模式进行检测。根据2015版《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则进行方法学考察。使用DAS 3.0软件进行药时曲线的拟合,并使用非房室模型统计矩方法计算各个目标组分的药代动力学参数。结果:牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷在大鼠血浆中的线性相关系数范围在0.9939～0.9987之间,日内和日间精密度的RSD≤11.73%,准确度RE在-3.40%～2.29%之间,提取回收率≥76.40%,基质效应均值在96.98%～110.05%之间,稳定性RSD范围为0.97%～13.76%。4种黄酮类化合物在大鼠血浆中的专属性、线性、精密度、稳定性、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量方法的要求。大鼠口服给予山楂叶提取物后,牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷表现出相似的药代动力学特征,分别在1.33 h和1.21 h达到最大血药浓度Cmax,t1/2为2.8 h左右,清除率CLz分别为13.47、15.20 L/h/kg。牡荆素在0.49±0.15 h达到Cmax,t1/2为4.45±2.02 h,Vz为219.71 L/kg,牡荆素的t1/2和Vz较其它3种黄酮类成分大,在体内消除较慢且主要分布于组织中。金丝桃苷在0.51±0.13 h达到最大血药浓度,t1/2仅为0.89±0.15 h,CLz为62.66 L/h/kg,金丝桃苷入血迅速,消除速度和程度较大。牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素均在入血后12 h处出现第2个吸收峰,可能存在肝肠循环。结论:在第二部分建立的UPLC-MS/MS分析方法基础上,成功优化血浆样品预处理方法,增强了对牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素和金丝桃苷4种目标组分的响应,并成功应用于山楂叶提取物经口服给药后4种黄酮类成分的含量测定。山楂叶提取物经口服给药后,牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷表现出相似的药代动力学特征,牡荆素比其它3种黄酮类成分在体内消除慢且在组织中分布高,金丝桃苷入血后能快速吸收且消除迅速。