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本研究采用比较蛋白质组学( Comparative Proteomics)和Shotgun Proteomics及MudPIT,详尽研究谷氨酸棒杆菌分解代谢芳烃化合物的蛋白质组和苯甲酸分解代谢的膜蛋白质组。
谷氨酸棒杆菌分解代谢龙胆酸、葡萄糖的胞内蛋白质组表达谱的比较分析,得到108个差异显示蛋白,选用MALDI-TOF-MS和Q-TOF鉴定了78个差异显示蛋白的功能:其中主要包括:直接参与龙胆酸分解代谢途径的酶;参与TCA循环、糖酵解和糖异生作用的酶;与硫代谢和胁迫相关的蛋白;参与核酸代谢、转录、翻译修饰的蛋白;以及与膜、转运相关的蛋白等。分别对具有途径代表性的芳烃化合物(苯甲酸、苯酚、对甲酚、间苯二酚)的分解代谢进行比较蛋白质组学研究。结果表明:参与代谢途径的酶被底物专一性诱导表达;芳烃化合物的分解代谢对中心代谢平衡有较大影响,致使多个关键性酶发生不同的变化;其中,果糖1,6-二磷酸酯酶在所试芳烃化合物分解代谢中被诱导而上调表达;结合分子生物学和生物化学的方法对其作用进一步研究。结果证实:果糖1,6-二磷酸酯酶的突变株(WT△ fbp)失去分解代谢龙胆酸的能力,其互补株(WT△fbp(pVWExl-fbp))恢复分解代谢龙胆酸的能力;并且,无机盐培养基中加入少量的葡萄糖可以恢复突变株(WT△fbp)分解代谢龙胆酸的能力。本研究首次证实:糖异生作用是芳烃化合物分解代谢必需的,果糖1,6-二磷酸酯酶在芳烃化合物分解代谢和中心代谢地相互联系中起到重要的作用。
比较分析谷氨酸棒杆菌分解代谢对甲酚的蛋白质组表达谱(以葡萄糖的为对照),发现三个尚未确定生物学功能的蛋NCg10524,NCg10525,NCg10527被对甲酚的分解代谢专一性诱导表达,为进一步研究对甲酚的分解代谢途径提供了靶蛋白。
选用LTQ-Orbitrap,采取Shotgun Proteomics方法研究谷氨酸棒杆菌分解代谢苯甲酸的膜蛋白质组。用MudPIT技术结合SIMPLE鉴定了1265个蛋白(平均每个生物样品鉴定的蛋白数),其中主要包括跨膜蛋白(32%)、分泌蛋白(12%),及一些与膜连接紧密的胞质内蛋白。为了相对定量地分析膜蛋白在不同碳源条件下的差异表达,采用15N内源代谢标记方法处理蛋白样品,用MudPIT分析鉴定了52个显著差异表达蛋白:30个蛋白被苯甲酸诱导而上调表达,22个蛋白受苯甲酸分解代谢的影响而下调表达丰度。其中,参与能量代谢的琥珀酸脱氢酶的A、B亚基(SdhA,SdhB)、AIP合成酶的不同亚基(AtpA,AtpB,AtpC,AtpD,AtpH)和糖转运蛋白被苯甲酸的分解代谢诱导而上调表达量;由于苯甲酸的分解代谢的影响,与细胞壁生物合成相关的酶(Cop1,Wzz,Embc)、参与渗透调节的蛋白(Msc1)及未确定生物学功能的碳胁迫蛋白、跨膜蛋白也发生差异表达。苯甲酸分解途径的酶:苯甲酸1,2-双加氧酶-α-亚基(BenA/NCg12320)和1,2-二羟基苯甲酸脱氢酶(BenD/NCg12323)及LuxR家族的细菌转录调控因子(BenR/NCg12324)被诱导表达;在蛋白表达水平鉴定BenK被诱导高表达而BenE的表达量没有达到最低检测限。采用RT-PCR方法,进一步检测转运蛋白基因benK、benE在转录水平的表达情况。结果表明:benK在转录水平的表达比benE显著得多。因此,结合基因组、转录组和蛋白质组的研究,充分证实了BenK是谷氨酸棒杆菌的苯甲酸转运蛋白,而BenE只在benK缺失情况下才行使跨膜转运苯甲酸的功能,或许参与其它新的功能,需要进一步研究。