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目的:免疫相关性全血细胞减少症(Immnorelated pancytopenia,IRP)是一种由于某些原因导致机体产生了抗骨髓造血细胞自身抗体,因此机体的正常造血功能受到破坏(抑制)所导致的疾病。临床可主要表现为不同程度的贫血、出血、感染。白介素35(interleukin 35,IL-35)是IL-12家族的新成员。它不仅是一种新型的抗炎因子,也广泛参与了体内免疫应答的过程。研究目的为检测IRP患者IL-35水平的变化及原因,并探究IL-35与Th17细胞的关系及其在IRP发病机制中的作用。材料、方法:研究对象为IRP患者共43人。其中初治组患者18人;经免疫抑制治疗(输血依赖患者经大剂量静脉丙种球蛋白治疗)后血象符合IRP疗效缓解标准患者(缓解组)25人;正常对照组19人。第一部分IRP患者外周血IL-35水平检测。ELISA法测定研究对象外周血血浆中IL-35的水平,并与IRP患者外周血血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(N%)、网织红细胞比例(Ret%)及CD5~+CD19~+B细胞占淋巴细胞和CD19~+B细胞的百分比做相关性分析;流式细胞术(FCM)检测外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T(Treg)细胞(IL-35的主要分泌细胞)占淋巴细胞及CD4~+T细胞的百分比;免疫磁珠分选研究对象CD4~+CD25~+Treg细胞,实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测IL-35亚单位(Ebi3、p35)m RNA的表达情况。第二部分探究IL-35与Th17细胞的关系。用流式细胞术(FCM)检测IRP患者及正常对照外周血(CD4~+IL17~+)Th17细胞占CD4~+的比例,并用ELISA法测定研究外周血血浆中IL-17的水平,并与其IL-35水平做相关性分析。分选除5例IRP初治患者CD4~+T细胞,与人融合性蛋白IL-35体外混合培养3天,FCM分析其Th17细胞占CD4~+T细胞的百分比变化;RT-PCR检测glycoprotein 130(gp130)、IL-12受体β2链(IL-12Rβ2)、维甲酸相关孤核受体(retinoic acid-related orphan receptor,ROR)γt、IL-17a的m RNA表达量。结果:第一部分IRP患者外周血IL-35水平检测。1.IRP初治组IL-35的水平(20.59±6.05pg/ml)明显低于缓解组(30.75±10.6pg/ml,P<0.01)与正常对照(98.45±57pg/ml,P<0.01)。将IRP缓解组患者按照其膜抗体检查结果,分为膜抗体阳性组(膜抗体~+组)及膜抗体阴性组(膜抗体-组),并与初治组的IL-35水平进行比较发现,初治组外周血血浆IL-35低于膜抗体~+组(29.66±8.41 pg/ml,P=0.013)及膜抗体-组(31.64±8.41 pg/ml,P<0.01),IRP患者外周血血浆IL-35水平与临床指标做相关性分析发现,它与外周血Hb(P<0.01,r=0.62)、WBC(P<0.01,r=0.429)及Plt(P<0.01,r=0.558)水平呈正相关。CD5~+CD19~+细胞占淋巴细胞百分比(P=0.03,r=-0.30)及CD19~+细胞的百分比(P<0.01,r=-0.308)均与血浆IL-35浓度呈负相关,而其与N%和Ret%之间的关联则并无明显的统计学意义。2.CD4~+T细胞在淋巴细胞中所占的比例在初治组、缓解组及正常对照组中分别为(29.80±3.87)%、(34.15±4.48)%、(37.97±6.05)%;初治组及缓解组与对照组相比均有显著降低(P<0.01),而初治组与缓解组相比,也是有统计学意义的(P<0.01)。CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞在CD4~+T细胞中所占的百分比,初治组(1.43±0.75%)与缓解组(1.86±0.79)%均比对照组(2.70±0.75)%有显著降低(P<0.01),而初治组与缓解组相比较并无显著差别(P=0.08)。3.初治组、缓解组及对照组CD4~+CD25~+Treg细胞内IL-35亚单位Ebi3m RNA水平(2-△△CT)分别为(0.16±0.13)、(0.43±0.54)及(1.20±0.80)。初治组及缓解组的m RNA表达水平与对照组相比均显著降低(P<0.01),且有统计学意义,而初治组与缓解组之间相比则并无明显差异(P=0.124)。另一亚单位p35在三个组中的m RNA表达水平(2-△△CT)则分别为(0.23±0.40)、(0.66±0.60)、(1.28±0.87)。其中初治组m RNA表达水平与正常对照组有显著差异(P<0.01),第二部分探究IL-35与Th17细胞的关系1.初治IRP患者Th17(CD4~+IL17~+)细胞占CD4~+T细胞的百分比(4.83±2.53)%明显高于正常对照(1.8035±0.9225)%,(P<0.01)。经过治疗,IRP患者的Th17细胞百分比有明显降低(2.214±1.12)%(P<0.01),但仍然比正常对照高(P=0.04)。IRP初治组IL-17的水平(273.48±59.74 pg/ml)明显高于缓解组(206.56±45.09pg/ml,P<0.01)及对照组(171.29±27.69 pg/ml,P<0.01),而缓解组与对照组相比也有明显增高(P<0.01)。与IL-35浓度的相关性分析显示:IRP患者外周血血浆IL-35浓度及IL-17浓度呈明显负相关(r=-0.55,P<0.01)。2.混合培养3天后,a组(IRP初治患者CD4~+T淋巴细胞空白组)Th17细胞占CD4~+T细胞百分比(6.94±1.88)%与b组(CD4~+T淋巴细胞与anti-CD3抗体,anti-CD28抗体,TGF-β,IL-6混合培养)相比(10.95±3.72),明显降低(P=0.044),b组与c组(CD4~+T淋巴细胞与anti-CD3抗体,anti-CD28抗体,TGF-β,IL-6,IL-35混合培养)(7.06±2.75)%相比,Th17细胞百分比有所增高(P=0.048)。3.混合培养三组(a组、b组、c组)检测gp130的m RNA表达水平分别为(1.57±1.45)(6.17±5.91)、(13.13±10.47),c组与a相比有明显增高(P=0.023),另一受体亚单位IL-12Rβ2的m RNA表达量分别为(2.50±2.87)、(3.15±4.53)、(8.03±6.51),尽管c组在三组中表达量最高,但每组之间相比均无统计学意义。RORγt的m RNA表达量在三组间分别为(1.11±0.50)、(6.44±5.93)、(1.57±0.87),b组m RNA表达水平最高(与a组相比P=0.032,与c组相比P=0.046)。IL-17a的m RNA表达量在b组中最高(10.95±3.72),与a组(6.94±1.88,P=0.018)及c组(7.06±2.75,P=0.023)相比均有统计学意义。结论:1.IRP患者外周血血浆IL-35水平较正常对照组明显降低;缓解组外周血血浆IL-35水平较初治组明显增高。CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞比例的降低及该细胞中IL-35m RNA表达水平的降低可能是IL-35水平降低的原因之一。2.IRP患者Th17细胞及血浆IL-17水平较正常对照组明显增高。体外混合培养实验证明IL-35可抑制IRP患者CD4~+T淋巴细胞分化为Th17细胞,这种抑制是通过IL-35对其受体亚单位gp130的激活进而抑制转录调节因子RORγt所实现的。