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目的： 原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是肌肉收缩过程中的一种调节蛋白。本课题将基因重组的人平滑肌TM的同源体-β（hsmTM-β）表达于人冠状动脉平滑肌细胞（CASMC）中，旨在探讨TM对血管平滑肌细胞（VSMC）游走能力的影响，为探索平滑肌中原肌球蛋白的作用开辟新径。 方法与结果： 一．基因重组hsmTM-β 采用套式PCR技术，从人主动脉cDNA文库中扩增hsmTM-β的cDNA目的基因片段，用dGTP和T4 DNA聚合酶修饰；在逆转录病毒载体pLIB基础上正向插入AS-RI-Nru片段构建载体pLIB-AS，用限制性内切酶NruⅠ和EcoRI消化。目的基因和载体经酚氯仿抽提，盐乙醇沉淀纯化后，用GENECLEAN Turbo核酸纯化试剂盒从琼脂糖胶中提纯DNA，最后在DNA连接酶作用下，将hsmTM-β的cDNA反插入pLIB-AS中，获得重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β。用热休克法将重组DNA转化入感受态大肠杆菌XL10-Gold中，重组质粒按质粒的小规模制备的碱裂解法提取和纯化后，用限制性内切酶EcoRI验证其全长，用PCR方法验证其插入片段。结果显示用反插入法可以实现hsmTM-β的基因重组。借助DNA SIS软件分析人平滑肌TM和鸡平滑肌TM的cDNA核苷酸序列，发现二者同源性达84.7％。 二．hsmTM-β重组体的转染和表达 参照逆转录病毒基因的转染和表达使用手册，在DMEM和SmBM细胞培养液中分别培养人胚肾细胞（AmphoPack-293）和人冠状动脉平滑肌细胞（CASMC）至第三代，用CalPhosTM哺乳类转染试剂盒，将hsmTM-β重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β和含有增强绿色荧光蛋白（EGFP）cDNA的重组质粒pLIB-EGFP分别转染进AnlphoPack一293中，产生逆转录病毒，然后感染CAsMC使基因表达。用chariot蛋白转染试剂盒将鸡胃平滑肌原肌球蛋白（gTM）转染进hsmTM一p/AS反义表达组细胞中。蛋白表达用Westem Blot法检测。 三.WestemBlot分析 从CASMC中获取胞质蛋白，经12.5%SDS一AGE电泳后，将蛋白转至PDVF膜上，用Westem blot法分析TM表达。PDV下膜用5%脱脂奶粉封闭液过夜后，以兔抗原肌球蛋白多克隆抗体为一抗（l:1000），抗兔免疫球蛋白抗体为二抗（1: 5000），结果显示以纯gTM为标准，与对照组和EGFP表达组相比，基因重组后的hsmTM一p表达敲除。在hamTM一p/AS反义表达组细胞补充了gTM后表达平滑肌原肌球蛋白（s mTM），并随gTM蛋白转染量增多smTM表达增多。 四.VSMC游走测定 用Boyden’5 Ch田刀ber方法测定vSMC的游走，聚碳酸盐滤过膜使用前以0.01%I型胶原包被。培养的CASMC细胞以2 xl护/ml的密度经胰蛋白酶消化后悬于游走细胞培养液DMEM（含0.4%BSA）中。于Ch田刀ber的上室加感染不同质粒的CASMC;下室加含有PDGF一BB和不含有PDGF一BB游走细胞培养液。将Chamber移至二氧化碳孵箱中，37oC孵育5小时。随机选取四个400X高倍视野（4H卫F）内游走细胞平均数评估细胞游走能力。 在PDGF一BB趋化剂刺激下，与对照组和EGFP表达组相比，单纯hsmTM一p/AS反义表达组细胞游走能力明显增强（P<005）。细胞的随机游走能力在hemTM一p基因敲除时同样增强（P<0.05）。在hsmTM一侧AS反义表达组细胞补充gTM之后，hsmTM一p基因敲除对细胞游走的刺激作用消失口<0.05)。 结论 人平滑肌TM一p和鸡胃平滑肌TM一p的cDNA核昔酸序列的同源性达84.7%。反插入法可实现hsmTM一p的基因重组，westem blot证实hsmTM基因敲除。Boyden’s Chamber法测定平滑肌细胞游走，在PDGF一BB趋化剂下和细胞随机游走下hsmTM一p基因敲除后CASMC的游走能力均增强。