高效液相色谱荧光柱前衍生检测羰基类化合物的研究

来源 :武汉理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:slrjlc2009
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羰基类化合物广泛存在于生物体内,虽然含量较少但在生命活动中却发挥着至关重要的作用。鉴于羰基类化合物的重要性,建立高效的分析方法以对其进行高选择性、高灵敏度检测是当前研究的热点之一。然而,直接检测生物样品中的羰基类化合物面临着诸多困难,如生命体内羰基类化合物含量极低且易受其它杂质的干扰,许多羰基类化合物无生色团或荧光团,无法对其进行光学检测等。高效液相色谱以其分离能力强、适用范围广且重现性好等优良性能逐渐成为分析工作者青睐的现代分析工具之一。荧光检测器具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽等其它检测器不可替代的优异性能。因此,利用高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FD)对羰基类化合物进行检测有显著的优势。本文采用新型胺氧基香豆素类荧光衍生试剂,通过胺氧基与羰基的缩合反应,成功对两类重要的羰基类化合物进行了标记,对羰基类化合物模型聚糖麦芽七糖和植物激素茉莉酸进行了有效的柱前衍生与高效液相色谱荧光检测分析。实验内容和实验结果主要分为以下三部分:第一部分,新型香豆素类物质荧光光谱及荧光量子产率的测定。首先,检测三种不同结构的新型胺氧基香豆素在不同pH条件下的荧光激发和发射波长以及荧光强度的变化并计算其荧光量子产率。实验发现,4-胺氧基亚甲基-7-羟基-香豆素不仅荧光性质稳定、Stocks位移大(λexem=325 nm/470 nm),而且其荧光量子产率高达0.98,表现出优越的荧光性能。第二部分,麦芽七糖的柱前衍生及其高效液相色谱荧光检测研究。首先,在酸性条件下,成功利用荧光衍生试剂4-胺氧基亚甲基-7-羟基-香豆素对麦芽七糖醛基还原端进行了荧光标记。通过调节液相色谱二元梯度洗脱程序,得到最佳的色谱分离条件。通过质谱对衍生产物进行了准确的表征;其次,考察了温度、时间、缓冲液pH值(包括缓冲液浓度)、荧光试剂与麦芽七糖摩尔比以及催化剂等因素对衍生反应的影响,成功优化出最佳反应条件;最后,选择适宜的反应条件,以温和的还原剂氰基硼氢化钠为氢化试剂成功将衍生产物肟式结构的碳氮双键还原成碳氮单键,这种方法可以避免产生多个衍生产物异构体的色谱峰,使衍生产物色谱峰更加稳定,为我们准确定量分析聚糖奠定了重要的基础。第三部分,高效液相色谱荧光检测对植物激素茉莉酸的研究。探究了两种新型胺氧基荧光衍生试剂4-胺氧基-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑NBD-AO与4-胺氧基亚甲基-7-羟基-香豆素对植物激素茉莉酸的荧光衍生效果。结果发现,4-胺氧基亚甲基-7-羟基-香豆素对植物激素茉莉酸表现出良好的衍生效果,通过在流动相中添加0.1%三氟乙酸水溶液调节基线,改善二元梯度洗脱程序,成功分离出衍生产物色谱峰,之后优化出最佳温度、时间、缓冲液pH值、4-胺氧基亚甲基-7-羟基-香豆素与茉莉酸摩尔比以及催化剂等因素对衍生反应的条件,这种方法具有极好的衍生效果。此外,本文探索了另外一种新型荧光试剂NBD-AO与茉莉酸的衍生反应,然而其荧光衍生效果并不明显,可归因于NBD-AO荧光分子结构以及茉莉酸空间位阻效应。本部分为茉莉酸的衍生及NBD类荧光衍生试剂分子结构的优化提供了重要的参考依据,针对茉莉酸的衍生,应该选择反应活性较好或者空间位阻较小的荧光衍生试剂为宜。
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