miR-34c和miR-449b对牛体细胞克隆胚早期发育的影响

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传统的观念认为精子在受精过程中主要是为受精胚胎提供父源单倍染色体和激活胚胎受精后发育的作用,而指导受精后胚胎发育的调控因子都是由卵母细胞提供的。这导致长期以来大部分研究者把寻找和鉴定跟表观重编程及胚胎发育相关的调控因子的工作聚焦在卵母细胞上。但是随着人们对精子的认识的深入,发现精子在受精过程中还会把少量的蛋白质、mRNAs、miRNAs及其它非编码RNAs物质等带入受精卵母细胞中。而精子在受精过程中带入的这些物质对雌雄原核的形成、卵裂球分裂的时空顺序、合子基因的转换、胚胎的发育能力甚至出生后代的表型等都有重要的影响。受精后,卵母细胞具有重编程精子细胞核的能力,以确保胚胎发育。而卵母细胞对精子的这种重编程形式,通过核移植(NT)的方式也能作用于体细胞核。以牛体细胞核移植技术的方式可产生克隆胚胎,这说明卵母细胞能够赋予体细胞核全能性。然而,体细胞核的重编程却不如精子细胞核的效率高。本实验通过筛选精子特异高表达的miRNAs,以诱导表达的方式赋予体细胞精子样的变化,并以此为供体细胞制备克隆胚胎。初步探索了精子中所携载特异高表达的miR-34c对牛体细胞克隆胚早期发育的影响。(1)通过qRT-PCR的方法,比较了miR-34c和miR-449b在牛胎儿成纤维细胞、精子、MII期卵母细胞中的表达情况,确定了miR-34c和miR-449b在精子中的表达量较高,而在体细胞、卵母细胞中的相对表达量非常的低。(2)通过构建miR-34c和miR-449b的Tet-On3G诱导表达载体,并筛选出阳性克隆细胞作为供体细胞。经强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导实验鉴定了miRNAs诱导表达载体的可行性。(3)以Dox诱导表达miR-34c的成纤维细胞作为供体细胞,通过NT技术制备的克隆胚胎为实验组,无Dox的为对照组。结果表明将精子中所携载的miR-34c通过诱导表达的形式赋予供体细胞,能提高胚胎发育能力、核重编程及胚胎质量。(4)完成构建psiCHECKTM-2-3′UTR双荧光素酶报告载体,探索了miR-34c/miR-449b对预测靶基因的影响,能引起Myc、HDAC1、E2F5、PDCD2表达下降,还需要进一步的证明。本实验确定了miR-34c能影响SCNT胚胎早期的发育,构建了miR-449b诱导表达载体并筛选了其阳性克隆细胞,为进一步提高核移植效率,阐明表观修饰异常的机理奠定了基础。
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