【摘 要】
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甜橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck）是我国最重要的经济果树之一,是芸香科柑橘属植物,其含有丰富的糖苷化合物。糖基化修饰是植物中广泛存在的修饰方式,在植物生长发育过程中起着重要作用。植物的糖基化修饰通常是在UDP-糖基转移酶（UDPGlycosyltransferase,UGT）的催化下,将UDP-葡萄糖的葡萄糖残基转移至受体分子上的过程。UGT基因是以基因家族的形式存在于植物
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甜橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck）是我国最重要的经济果树之一,是芸香科柑橘属植物,其含有丰富的糖苷化合物。糖基化修饰是植物中广泛存在的修饰方式,在植物生长发育过程中起着重要作用。植物的糖基化修饰通常是在UDP-糖基转移酶（UDPGlycosyltransferase,UGT）的催化下,将UDP-葡萄糖的葡萄糖残基转移至受体分子上的过程。UGT基因是以基因家族的形式存在于植物中,且该家族成员众多,因此在进行植物糖基化研究时,常常难以克隆到所需的UGT基因。本研究以甜橙中的伏令夏橙（Valencia）子房、花后20 d幼果、花后40 d幼果为实验材料,首先提取它们的RNA进行转录组测序,筛选出高表达的甜橙糖基转移酶（Cs UGT）候选基因,随后完成几个Cs UGT基因的全长克隆工作,并对克隆出来的Cs UGT基因的编码蛋白进行生物信息学分析,最后构建原核表达重组载体,进行原核表达实验分析,探索其蛋白表达的诱导条件。本研究筛选出来的Cs UGT基因将为后续基因功能解析提供基因资源,通过外源表达Cs UGT基因所编码的蛋白,也为后续在体外对UGT的生化功能进行研究奠定一定的基础,而对原核表达诱导条件的探索方式,也为后续研究者利用原核表达进行实验分析提供一定的实验思路。本研究取得的主要结果如下:1.通过转录组测序技术,分析转录组整体数据量及对数据进行评估,组装得到7831个高表达基因,再结合甜橙基因组数据库的注释信息和motif鉴定,筛选到36个高表达的Cs UGT基因,从36个Cs UGT基因中随机选取8个Cs UGT基因进行q RT-PCR验证,验证结果表明转录组数据具有一定的可靠性。2.将筛选到的36个Cs UGT基因的编码蛋白（Cs UGT）与51个功能已知的UGT构建蛋白进化树,通过进化聚类分析发现,有26个Cs UGT能够与功能标记蛋白聚类,其中6个Cs UGT能与激素糖基转移酶聚类,预测其可能参与了植物激素的糖基化修饰,20个Cs UGT能与类黄酮糖基转移酶聚类,预测其可能参与了类黄酮的糖基化修饰。3.利用PCR扩增技术,成功扩增出了6个具有完整ORF框的Cs UGT候选基因的c DNA全长序列,序列长度在1383-1512 bp之间。对这6个Cs UGT进行生物信息学分析,发现它们的氨基酸数在460-503之间,蛋白的预测分子量在51.70-56.55 k D之间,等电点在5.44-6.69之间,脂肪指数在85.11-98.90之间,非极性氨基酸残基（Asp+Glu）数在47-64之间,极性氨基酸残基数（Arg+Lys）数在39-59之间。2个Cs UGT的不稳定系数小于40,属于稳定蛋白,4个Cs UGT不稳定系数大于40,属于不稳定蛋白。亚细胞定位显示,6个Cs UGT中有3个可能定位于叶绿体,3个可能定位于细胞质。4.选择了p Cold TF和p MAL-c5X两个原核表达载体,构建了8个重组质粒,将8个重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中,进行原核表达分析和蛋白诱导条件探索。实验从原核表达载体、原核表达宿主菌株、蛋白诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度等方面对蛋白表达的诱导条件进行了探索。经SDS-PAGE电泳检测发现,这8个重组蛋白均可以表达出与预测蛋白分子量一致的融合蛋白,但融合蛋白大多存在于沉淀中,在上清液中含量较少,即代表这8个融合蛋白主要以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。
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