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近年来,药物载体的细胞学研究备受关注,大量研究表明深入探讨载体在细胞内的行为,对载体的设计具有事倍功半的意义。PAMAM-NH2树状大分子由于其结构的特殊性,不但是一种化学药物的载体,同时也可作为基因药物载体,具有广泛的应用性。本文以HepG2、MCF-7和MCF-7/ADR三种细胞为模型,系统地研究了 PAMAM-NH2在三种细胞内诱导细胞凋亡、细胞摄取、胞内转运与外排的过程及机制,全面阐明了其在不同肿瘤细胞内的行为,为其作为抗肿瘤药物载体的设计提供有益借鉴,尤其为其作为逆转多药耐药载体的设计提供了新的依据。本文使用MTT法,测定了 PAMAM-NH2对HepG2、MCF-7和MCF-7/ADR三种细胞的体外细胞毒,结果显示PAMAM-NH2对三种细胞的细胞毒具有浓度和时间依赖性,低浓度(1-50 μg/mL)时,三种细胞的细胞存活率始终保持在80%以上,基本没有细胞毒;高浓度下或者长时间作用后,三种细胞的细胞存活率均出现急剧下降。另外,通过MTT法确定了相关细胞转运实验中PAMAM-NH2的浓度为10 μg/mL。通过对细胞周期、JC-1线粒体膜电位、活性氧、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶活性等检测实验,初步确定了 PAMAM-NH2引起肿瘤细胞凋亡的机制。在三种细胞内,高浓度的PAMAM-NH2(>100 μg/mL)可以通过Caspase依赖的线粒体介导的内部凋亡途径诱导细胞凋亡,其作用发生在细胞周期的G0/G1期,处于这个期的细胞可直接进入凋亡状态。通过化学合成法,将异硫氰酸荧光素(FITC)连接到PAMAM-NH2表面,反应后PAMAM-NH2表面约13.67%的氨基连接上FITC,由于被反应的氨基较少,故对PAMAM-NH2表面正电性、PAMAM-NH2与细胞结合能力影响较小。利用流式细胞仪,检测了不同摄取时间和浓度对PAMAM-NH2在三种细胞内摄取量的影响,结果显示PAMAM-NH2在三种细胞内的摄取均具有时间依赖性和浓度依赖性。在三种细胞中PAMAM-NH2最终都能达到摄取平衡,三种细胞对PAMAM-NH2摄取的饱和浓度都是50μg/mL。但是三种细胞摄取率不同,HepG2细胞对其摄取率最高,MCF-7/ADR细胞摄取率最低。PAMAM-NH2在HepG2细胞和MCF-7细胞中摄取量的差异来自于其在两种细胞表面的结合量不同;而PAMAM-NH2在MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞中的摄取量相异,分别来自于其在两种细胞表面结合量差距和两种细胞对PAMAM-NH2外排的差异。利用不同内吞抑制剂,发现pAMAM-NH2在三种细胞内的内吞途径不同。PAMAM-NH2通过网格蛋白介导的内吞途径进入HepG2细胞;PAMAM-NH2通过网格蛋白介导的内吞途径和巨胞饮途径进入MCF-7和MCF-7/ADR细胞,而在MCF-7细胞中网格蛋白介导的内吞途径起主要作用,在MCF-7/ADR细胞中巨胞饮途径起主要作用。另外利用低温和蔗糖对细胞进行处理,发现PAMAM-NH2可通过在细胞膜上打孔的方式进入三种细胞。利用胞内转运抑制剂,发现PAMAM-NH2在三种细胞内的摄取是相对独立的过程,只与溶酶体有关,与内质网到高尔基体途径和高尔基体到细胞质膜途径都没有关系。利用细胞器的各种荧光探针标记各种细胞器,发现PAMAM-NH2在三种细胞内均能够与溶酶体、线粒体、细胞核和微管共定位。在三种细胞中的入核率顺序为:HepG2细胞>MCF-7细胞>MCF-7/ADR细胞。利用激光共聚焦共定位定量分析法和溶酶体膜完整性法,证明了与敏感细胞相比,PAMAM-NH2更难逃逸耐药细胞的溶酶体。通过流式细胞术,检测了PAMAM-NH2在三种细胞内外排情况。研究发现,PAMAM-NH2在耐药细胞中的外排量明显高于其它两种普通肿瘤细胞,这是因为耐药细胞上的P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白对PAMAM-NH2有很明显的外排作用。通过加入胞内转运抑制剂,发现HepG2、MCF-7和MCF-7/ADR三种细胞对PAMAM-NH2的外排途径一致,包括三个过程:溶酶体的消化外排、内质网向高尔基体的转运和高尔基体向细胞质膜的转运。激光共聚焦结果显示HepG2细胞和MCF-7/ADR细胞内的内质网和高尔基体对PAMAM-NH2的外排作用一样;MCF-7细胞内的高尔基体对PAMAM-NH2的外排作用更大。在三种细胞里,细胞核内的PAMAM-NH2可以很快地被排出,而胞浆残留的PAMAM-NH2很难被排出。利用表面基团不同的PAMAM-OH为对照,探讨了 PAMAM-NH2在MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞内的细胞毒、时间摄取依赖性、溶酶体定位和外排曲线行为都不相同的原因。结果表明,PAMAM-OH在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中的这几个行为都一样,说明PAMAM-NH2表面的氨基对这些行为产生了影响。PAMAM-OH表面的羟基在生理条件下不带电,而PAMAM-NH2表面的氨基在生理条件下带正电,使PAMAM-NH2细胞毒更强,因此耐药细胞的多药耐药性对PAMAM-NH2影响更大;另外,PAMAM-NH2会被P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白识别而产生外排,而PAMAM-OH不会被多药耐药蛋白识别。进一步证实由于PAMAM-NH2表面氨基的存在,使得耐药细胞对PAMAM-NH2 有影响。