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研究背景和目的近年来,手足口病(HFMD)在全世界尤其是亚太地区,都有不同程度的大规模暴发流行。肠道病毒71型(EV71)导致的HFMD严重危害儿童健康。EV71是HFMD的主要病原体,也是导致手足口病重症、死亡病例的主要病原体。由EV71引起的手足口病可发展为重症的神经系统疾病,进展迅速,病死率较高。目前还不明确上市的EV71灭活疫苗对于重症HFMD是否有预防作用,EV71感染和重症HFMD的致病机制亟待阐明。细胞自噬(autophagy)是普遍存在于真核生物中的一种细胞内降解过程。自噬是一种重要的抗病毒机制,但许多研究表明,RNA病毒可以利用自噬以促进自我复制。EV71可以诱导并利用自噬,以促进自身感染。VP1是EV71的结构蛋白,集中有主要的中和抗原决定簇,研究意义重大。已有研究发现EV71 VP1可以诱导自噬,但该机制还不清楚,需要进一步研究。VP1可与细胞表面受体结合,与许多宿主蛋白存在相互作用。本课题组发现了 EV71 VP1与宿主蛋白PHB2间可能存在相互作用。PHB2是自噬相关蛋白,可能通过自噬参与EV71感染。需要进一步验证两者的相互作用,并探索PHB2对EV71感染与自噬的影响。研究方法1.筛选与EV71 VP1具有相互作用、可能调控自噬的宿主蛋白,并进行验证。通过质谱技术,得到与EV71 VP1可能存在相互作用的蛋白。筛选得到感兴趣的蛋白PHB2,随后通过免疫共沉淀进行验证。免疫荧光检测两者的共定位。2.宿主蛋白PHB2在EV71感染与自噬中的作用。靶向PHB2的siRNA(SiPHB2)转染后、EV71感染RD细胞,CCK-8检测细胞存活率,qPCR检测细胞内病毒RNA,TCID50检测上清的病毒滴度,Western Blot检测病毒与自噬蛋白。3.EV71在自噬溶酶体的感染情况研究。溶酶体酸化抑制剂Bafilomycin Al(Baf-Al)处理后,EV71感染RD细胞,qPCR检测细胞内病毒RNA,TCID50检测上清的病毒滴度。选用ATP6AP2基因敲除溶酶体质子泵(V-ATPase)。SiATP6AP2转染后、EV71感染RD细胞,CCK-8检测细胞存活率,qPCR检测细胞内病毒RNA,TCID50检测上清的病毒滴度,Western Blot检测病毒与自噬蛋白。结果1.质谱显示PHB2可能与EV71 VP1相互作用。免疫共沉淀结果验证了 VP1与PHB2的相互作用。EV71感染12h、24h、48h后,免疫荧光发现了 VP1与PHB2具有共定位。2.EV71感染48h后,PHB2敲除导致细胞存活率增加。感染12h、24h、48h后,PHB2敲除导致病毒复制、释放、VP1表达减少。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ减少,自噬受到抑制。同时,PHB2敲除也抑制了 rapamycin诱导的自噬以及VP1表达。3.Baf-Al处理导致病毒复制、释放显著减少。EV71感染48h后,ATP6AP2敲除导致细胞存活率增加。感染12h、24h、48h后,ATP6AP2敲除导致病毒复制、释放、VP1表达减少。同时溶酶体pH、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与P62表达均增加,溶酶体的酸性降解环境受到破坏。结论1.EV71 VP1蛋白与宿主蛋白PHB2相互作用。2.PHB2通过自噬参与EV71感染。3.EV71感染部分依赖于自噬溶酶体的酸性环境。