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分子克隆技术是现代生物学研究中最基本最常用的方法,尽管该技术的发展已十分成熟,并且广泛应用于生物学研究的各个领域,但对于大于50 kb的基因组大片段DNA的克隆仍然存在扩增困难,特异性低,成本高等问题。CRISPR-Cas9系统是近年在某些原核生物中发现一种的II型CRISPR-Cas系统,微生物利用crRNA和tracrRNA介导的Cas9蛋白特异性酶切外源噬菌体DNA或质粒,从而防御其入侵。由于其高度的特异性和可编辑性,研究人员将其改造成各种用于基因编辑,表达调控和细胞成像的工具,并应用于从低等到高等各种模式生物中。本研究利用这一系统的高度特异性,在琼脂糖胶块中通过体外转录得到的sgRNA介导表达纯化的Cas9蛋白对目标基因组进行酶切。基因组酶切产物通过Gibson Assembly原理直接连接到末端具有与目标片段同源的序列的克隆载体上,重组质粒由电击法转化进入大肠杆菌感受态中完成克隆。根据其技术特点,本方法被命名为Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments(CATCH)。本研究设计成对的sgRNA对大肠杆菌基因组进行酶切,脉冲场电泳结果显示不同长度(50-200 kb)的目标条带均能够从基因组中有效分离。克隆实验结果显示50-100 kb的大片段DNA克隆可以实现约20-60%的阳性率,与普通短片段DNA的克隆效率相当。其克隆阳性率与DNA片段长度成负相关,100 kb以上的长片段DNA较难一次性获得。实验证明sgRNA的方向及其靶点在基因组上的位置对酶切及克隆效率没有显著影响。应用该方法,本研究已成功在大肠杆菌、芽孢杆菌、委内瑞拉链霉菌、金黄色链霉菌等多种微生物中成功分离及克隆基因组大片段DNA或基因簇。与应用传统PCR技术分步整合获得大片段DNA的方法相比,CATCH技术可以将大片段DNA一次分离及克隆;与应用传统限制性核酸内切酶消化全基因组获得大片段DNA的方法相比,CATCH技术具有更长的且可编辑的识别位点,因此具有更高的特异性和灵活性。该技术的应用将极大简化对能够表达具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步骤,节省时间并降低成本,有望广泛应用于合成生物学及基因组测序等领域。