目的:建立大鼠脊髓损伤模型,利用多光子显微成像技术观察雷帕霉素是否通过SCI损伤后早期激活自噬促进损伤区域神经元的存活和轴突的延长,揭示脊髓损伤后自噬激活对神经元细胞及轴突的影响及对大鼠后肢运动功能的保护作用。方法:(1)清洁级SD雌性大鼠,随机分为4组:正常对照组、安慰剂组、雷帕霉素组、3-MA组,Allen法建立大鼠脊髓损伤模型(打击部位为T10),并用BBB评分评价损伤后不同时间点(1h、6h、1d、3d、5d、7d、10d)各组大鼠后肢运动功能的改变情况;(2)在损伤后不同时间点处死老鼠,取脊髓组织标本,Western blot检测自噬相关蛋白LC3II、Beclin1的表达,观察损伤后不同组别、不同时间点自噬蛋白的表达情况(3)将收集的脊髓标本进行切片,HE染色法于普通光镜下观察脊髓组织的变化情况并后期与多光子显微镜下观察的图像进行对比;(4)在多光子显微镜下进行观察,利用先进的图像分析和光谱分析技术,从微结构和光谱角度反映不同阶段神经纤维的形态结构特征,获得能够定量反映轴突损伤修复过程不同阶段轴突坏死及存活的变化趋势的光学参数指标。结果:(1)从损伤后第5d时间点开始,雷帕霉素组大鼠BBB评分明显高于安慰剂组和3-MA组,差异具有统计学意义,组间差别也具有统计学意义(p<0.05);(2)证实了大鼠脊髓损伤后诱导自噬:Western blot结果显示大鼠脊髓损伤后6h可观测到自噬相关蛋白的升高(p<0.05),3d时到达高峰(p<0.05);药物调控自噬后,在第3d时间点可以观察到雷帕霉素组自噬活性明显较安慰剂组升高,3-MA组则降低,组间差别具有统计学意义(p<0.05);(3)显微镜观测结果:1、HE染色:光镜下可见正常对照组大鼠脊髓神经元形态正常,细胞结构完整清晰,排列整齐紧密,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆透明,染色质均匀分布,核仁清晰,轴突形态完整,无断裂或者紊乱;安慰剂组神经元形态不完整,排列紊乱,细胞肿胀,破裂,细胞间距加大,轮廓模糊,界限不清,存在大量变性、坏死神经元胞体,细胞核浓缩,核固缩,核仁不清晰,失去正常结构;雷帕霉素组从第3d开始损伤程度明显较安慰剂组减轻:细胞水肿程度减小,染色均匀,细胞水肿程度较小,而3-MA损伤程度则较安慰剂组加重。2、多光子显微镜量化损伤参数:ECM含量:安慰剂组ECM含量在损伤后呈持续下降趋势,在第3d时间点达到最低,之后缓慢升高;第3d时间点的组间对比中3-MA组的ECM含量为最低,雷帕霉素组ECM含量则高于安慰剂组,组间差异有统计学意义(P<0.05);腔密度:脊髓损伤时腔密度明显升高,在第3d趋于稳定,在第3d时间点腔密度的检测中,我们发现雷帕霉素组与安慰剂组和3-MA组相比有更低的腔密度值,提示ECM形态较为完整,3组实验组间的差别有统计学意义(P<0.05);出血:由于红细胞中血红蛋白的强TPEF信号发出红色荧光,通过计算光谱强度的不同我们发现:脊髓损伤各时间点均存在出血信号,1d到达高峰,但是在第3d时间点血红蛋白TPEF信号开始降低,推测由于自噬的活跃出血被逐渐吸收导致光谱强度的降低;3d时间点各组光谱信号的比较可以看出雷帕霉素组呈现的出血信号最低,表明出血较少或吸收较快,3-MA组则表现出较高的出血信号,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)证实了脊髓损伤后能诱导自噬;(2)通过早期促进自噬能促进大鼠神经元细胞及轴突的存活以及后肢运动功能的恢复,抑制自噬则促进神经元细胞和轴突的死亡,对大鼠运动功能的恢复起到不利的效果。(3)ECM的含量、腔密度和血红蛋白光谱强度变化可能是多光子显微镜定量监测SCI发展的有用指标。