论文部分内容阅读
RNA沉默是真核生物用于抵抗病毒等外来核酸入侵的保守机制，病毒在与寄主的长期互作中也进化出相应的防御机制即编码RNA沉默抑制子与之对抗。不同RNA沉默抑制子之间并无保守区域，作用方式也各不相同，沉默抑制能力也有所差异。研究RNA沉默抑制子功能，不仅能够明确抑制蛋白结构功能的关系，而且可以获得病毒寄主互作规律的更多信息，为抗病毒育种提供理论依据。本研究选取6种不同PVY分离物HC-Pro蛋白，利用农杆菌瞬时表达系统，对其沉默抑制能力进行了比较；对HVT063基因进行随机插入突变并鉴定了不同插入突变体沉默抑制能力。主要研究结果如下：（1）双荧光素酶检测体系的建立。从pRL-TK载体上克隆分离海肾荧光素酶基因，将其连接到表达萤火虫荧光素酶的植物表达载体pCAMBIA1301上，形成了表达两种荧光素酶的双元表达载体pCAMBIA1301-DL；构建萤火虫荧光素酶的shRNA表达载体pBI21-shLuc，其在农杆菌瞬时表达系统中可诱导萤火虫荧光素酶沉默。（2）不同PVY分离物HC-Pro蛋白沉默抑制能力的比较。从22种不同PVY分离物HC-Pro蛋白中选择6种序列差别较大的进行研究，克隆这6种PVY HC-Pro基因分别构建到植物表达载体pBI-121中，以绿色荧光蛋白（GFP）转基因本生烟16c为材料，利用农杆菌介导的瞬时表达体系鉴定并比较其沉默抑制功能。Northern Blot杂交和双荧光素酶检测均表明A33HC-Pro具有较强的RNA沉默抑制能力而HN6、HN10HC-Pro沉默抑制功能较弱。氨基酸序列比对表明，PVY HC-Pro中间区域的第149位天冬氨酸（D）、185位甘氨酸（G）、第186位谷氨酰胺（Q）可能是其沉默抑制的关键位点。A33HC-Pro侵染烟草产生的坏死症状要弱于HN6HC-Pro，表明HC-Pro沉默抑制活性与PVY致病性之间无直接联系，A33HC-Pro无法按照现有PVY分类方式对其进行分析，表明PVY在与寄主互作过程中发生变异。（3）利用随机插入突变体，研究沉默抑制子HVT063沉默抑制功能相关位点。利用转座子介导的突变系统对HVT063进行随机插入突变，共获得42种不同插入位点的突变体，构建42种突变体的表达载体并将其转化农杆菌GV3101，将其分别与pCAMBIA1301-DL、pBI121-shLuc混合，侵染野生型本生烟，利用农杆菌介导的瞬时表达体系对其沉默抑制功能进行鉴定。根据荧光素酶比值，可将42种突变体分为三类，16种突变体沉默抑制功能丧失，21种突变体沉默抑制能力减弱，5种突变体沉默抑制功能没有发生变化。结合HVT063空间结构预测，推测C端α螺旋区在更大程度上参与了RNA沉默，第231-252位氨基酸、第419-434位氨基酸可能是HVT063发挥抑制沉默的关键功能域。