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背景:特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质肺炎,易导致肺功能丧失;IPF诊断后,中位生存期仅为3年,死亡率高于大多数肿瘤;其临床治疗药物有限,目前国内只有吡非尼酮（PFD）和尼达尼布可用;但这些药物成本较高以及副作用大,对减缓疾病进展效果不甚理想,缺乏对IPF有效的防治和逆转的治疗手段,因此,亟需探索新的治疗策略和开发新药物。课题组前期研究首次发现,冬虫夏草菌丝体提取物（HSM）具有调节免疫、缓解纤维化小鼠疾病进程的作用:促使肺组织中炎性因子TNF-α和IL-1β及纤维化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9表达显著下降,肺组织炎性样病变明显改善,肺内及间质α-SMA和fibronection表达明显减弱,但是HSM抗肺纤维化的具体作用机制尚不明确。据报道,巨噬细胞自噬途径参与多种纤维化疾病,如肾纤维化、肝纤维化等。博来霉素（BLM）诱导肺纤维化小鼠模型中发现,肺泡巨噬细胞线粒体自噬水平升高,特异性的敲除线粒体自噬相关蛋白,小鼠肺纤维化症状明显缓解。由此,我们推测HSM缓解小鼠肺纤维化可能与巨噬细胞自噬有关。目的:本课题旨在利用BLM诱导小鼠肺纤维化动物模型,分析HSM缓解肺纤维化作用与肺部巨噬细胞自噬的相关性,探索其具体作用机制。方法:获取7-8周龄、雄性C57BL/6小鼠50只,随机分为5组:对照组（生理盐水）、模型组（BLM）、单独给药组（生理盐水+HSM）、治疗组（BLM+HSM组）、吡非尼酮阳性药物对照组（BLM+PFD）,每组10只动物。气管内滴注给予博来霉素（3mg/kg）（或生理盐水）,在第7天,分别灌胃给予HSM（200 mg/kg）、PFD（400mg/kg）或生理盐水,第28天,每组各取5只小鼠,腹腔注射乌拉坦（0.09-0.1ml/20g）麻醉,利用呼吸流量检测仪检测小鼠肺部呼吸功能,评价肺顺应性、肺通气量、气道阻力以及粘性阻力的水平。收集未灌洗肺组织中性甲醛固定后做HE染色、MASSON染色,使用羟脯氨酸试剂盒测定羟脯氨酸含量。收集肺泡灌洗液（BALF）,离心获取细胞,HE细胞染色,形态观察并进行细胞计数。流式检测BALF中肺泡巨噬细胞比例、绝对数及LC3B的表达情况。剩余灌洗后肺组织,经胶原酶消化、研磨分散后,制备单细胞悬液,利用流式细胞仪,检测肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞的比例和数量变化,以及LC3B的表达情况。透射电镜分别观察BALF和肺组织中自噬小体数量,RT-QPCR法检测肺组织中自噬相关基因（如Lc3b、Beclin1等）表达水平,Western Blot检测LC3B、BECLIN1、P62蛋白表达水平,以明确HSM对肺纤维化小鼠肺部巨噬细胞自噬的影响。体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,经自噬流阻断剂氯喹（CQ）、TLR4激动剂脂多糖LPS或TLR4抑制剂CLI095预处理,RT-QPCR法检测细胞中自噬相关基因（如Lc3b、Beclin1等）表达水平,Western Blot检测LC3b、P62蛋白表达水平,细胞免疫荧光技术检测细胞中LC3B的表达定位,评估HSM通过TLR4信号通路调控巨噬细胞自噬的具体机制。利用Prism5统计软件进行t检验中的成组设计两样本均数的检验,多组样本之间比较采用单因素方差分析,p＜0.05为差异具有统计学意义。结果:1.HSM可缓解纤维化小鼠肺部巨噬细胞的累积:首先,HSM显著改善纤维化小鼠肺组织病理损伤。与BLM组相比,HSM治疗组的肺组织病理损伤明显减轻,肺泡结构相对完整,肺泡壁未见明显增厚,炎性细胞浸润减少;肺组织结构中胶原纤维只有少量沉积;且组织羟脯氨酸含量降低。其次,HSM改善博来霉素诱导纤维化小鼠的肺功能障碍。小鼠肺功能检测发现,与BLM组相比,HSM治疗组小鼠肺顺应性指数、肺通气量增加,气道阻力和粘性阻力均有下降。再次,HSM减少纤维化小鼠肺部巨噬细胞的募集。HE染色观察BALF细胞,发现巨噬细胞数量在模型组显著升高,HSM治疗组数量下降（p＜0.01）;流式细胞术分别检测BALF和肺组织中肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞的数量,与BLM组相比,HSM治疗组肺泡巨噬细胞数量明显下降（p＜0.01）,这些结果提示,HSM可能通过巨噬细胞发挥其抗肺纤维化作用。2.在BLM诱导肺纤维化小鼠体内,HSM抑制巨噬细胞自噬:首先,获取小鼠肺组织,透射电镜结果显示,HSM治疗组自噬小体数量明显少于BLM组（p＜0.05）;自噬相关基因（如Lc3b、Beclin1）的表达也与此变化趋势相符;自噬蛋白LC3B、Beclin1表达在HSM治疗组明显下降,治疗组与模型组相比P62蛋白表达水平下降,这提示,在BLM诱导的纤维化肺组织内,HSM可减少自噬发生。进一步,分离培养获取肺泡巨噬细胞,电镜观察细胞内自噬小体,发现HSM治疗组自噬小体的数量明显低于BLM组,流式细胞术分析也显示,BALF中LC3B+肺泡巨噬细胞绝对数均显著低于BLM组,灌洗后肺组织内间质巨噬细胞LC3B表达比例和绝对数在HSM处理前后无显著变化,但肺泡巨噬细胞LC3B表达比例和绝对数较BLM组显著降低（p＜0.01）。这些结果说明,HSM可能通过调控肺泡巨噬细胞自噬,缓解肺纤维化疾病进程。3.体外研究发现,HSM通过TLR4信号通路降低巨噬细胞自噬:首先,我们利用氯喹（CQ）预处理RAW264.7巨噬细胞,阻滞自噬流,发现HSM（16μg/ml）处理细胞后,可降低Atg4b等自噬相关基因的表达,抑制LC3B蛋白表达,促进P62蛋白表达,提示,HSM可直接降低巨噬细胞自噬。根据文献报道,TLR4信号与细胞自噬有关。我们用CLI095,TLR4抑制剂处理后,HSM降低巨噬细胞自噬的作用被消除,推测HSM降低巨噬细胞自噬的作用于TLR4有关。接着,我们用TLR4激动剂——脂多糖（LPS）预处理巨噬细胞,HSM可直接抑制细胞膜表面TLR4表达,降低自噬相关基因（如Lamp1、Atg4b、Gabarapl1、Lc3b、Beclin1）表达,Western Blot和免疫荧光检测一致显示,HSM降低TLR4信号激活的巨噬细胞自噬。最后,我们通过检测TLR4信号通路的蛋白表达,发现HSM降低巨噬细胞自噬可能与降低NFκB磷酸化水平有关。结论:HSM可通过降低肺泡巨噬细胞自噬,缓解小鼠肺纤维化疾病进程,其降低巨噬细胞自噬可能与TLR4/NFκB有关。