前言目前全球约三分之一人口受到结核杆菌感染,每年死亡人数约300万人,卡介苗(BCG)作为目前唯一临床使用的疫苗,其预防效果并不稳定,研制新型的有效疫苗防治结核病成为当务之急。迄今为止对于结核杆菌的保护性抗原仍不十分明确,细胞外分泌性或细胞壁相关的蛋白被推测是保护性免疫应答识别的重要抗原。分泌型Ag85A被认为可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。比利时布鲁塞尔巴斯德研究所Huygen研究组多年来在对Ag85进行的研究中发现,携带Ag85基因的质粒DNA疫苗经肌肉注射给动物(小鼠),主要引起Th1型免疫应答,产生IL-2、IFN-γ和TNF-α,经基因枪注射则主要产生Th2型免疫应答和抗体产生水平增加。而口服减毒沙门氏菌携带Ag85DNA疫苗对小鼠免疫效应的影响目前尚无报道。通过基因工程制备的减毒沙门氏菌以其有效地递呈抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫等优势而被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。减毒沙门氏菌经口服途径免疫小鼠,不仅安全、高效,而且可激发产生黏膜反应,对同源病原体和异源病原体均表现出良好的保护力。本实验构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体并表达Ag85A蛋白,用以检测Ag85A特异性抗体及用于单克隆抗体的制备。并用减毒沙门氏菌携带Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,检测其免疫效应,为结核病DNA口服疫苗的临床应用进一步提供理论和实验依据。实验材料一、主要仪器流式细胞仪,二氧化碳孵箱,倒置显微镜,酶标仪,离心机,低温冰箱,超速离心机,超滤器,超净工作台等。二、主要试剂RPMI 1640培养基,大肠杆菌(Ecoli)BL21株,质粒pGEX-6p-1,AxyprepPlasmid Miniprep Kit,Axyprep DNA Gel Extraction Kit,Easy Taq DNA Polymerase,High Pure dNTPs,T4 DNA连接酶,Western-blot相关试剂,IPTG,BamHⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ限制性内切酶,SDS-PAGE电泳相关试剂,IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒。三、实验动物C57BL/6小鼠,6-8周龄,SPF级,购自中科院上海实验动物中心。实验方法一、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建与表达1、质粒的提取与鉴定取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ37℃水浴消化质粒,,酶切结果经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2、Ag85A编码基因的扩增以V1Jns.tPA-Ag85A为模板,PCR扩增目的基因Ag85A。3、重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A的构建用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切Ag85A PCR产物和pGEX-6p-1载体,用T4 DNA连接酶进行连接。4、转化及重组质粒鉴定将重组质粒转化大肠杆菌(Ecoli)BL21,用Axyprep Plasmid Miniprep Kit提取质粒,BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定并测序。5、蛋白表达检测IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blotting检测蛋白表达情况。二、口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A DNA疫苗免疫效应的研究1、口服疫苗的制备取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit从细菌中提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ于37℃水浴消化质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取收获的细菌进行10倍的倍比稀释后,将10~6,10~7,10~8倍稀释的菌液各取100μl接种于含有卡那霉素的固体琼脂平板中,计数菌落数。并依据公式推算出所收获细菌悬液中的细菌总数。2、实验动物分组及免疫C57BL/6小鼠,6-8周龄,雌性,随机分成3组:①Ag85A DNA质粒组;②空质粒对照组;③正常对照组。分别将伤寒杆菌菌苗和生理盐水以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫三次,每次间隔三周。分别于初次免疫后2w,4w,6w,8w颈椎脱位处死每组3-4只小鼠进行相关检测。3、ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体滴度眼球采血分离血清,ELISA法检测小鼠血清中Ag85A特异性抗体,酶标仪于450nm处测量OD值。4、ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量无菌取出感染小鼠脾脏,制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1×10~7/ml,24孔培养板上加入细胞悬液,500μl/孔,于37℃培养48h。1000g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ和IL-4检测。用双抗体夹心ELISA法对IFN-γ和IL-4的含量进行检测,酶标仪于450nm处检测OD值,应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。5、统计学处理实验数据经SPSS16.0统计分析软件应用方差分析方法进行统计处理,P<0.05有显著性差异。结果1、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建经双酶切证实成功构建了携带Ag85A基因的重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A,经测序分析,所克隆Ag85A基因序列与GenBank中结核分枝杆菌Ag85A序列完全相同。2、Ag85A蛋白的表达SDS-PAGE电泳及Western-blot检测IPTG诱导Ecoli BL21蛋白表达,在分子量为58KDa处有Ag85A融合蛋白的表达,与预期的蛋白分子量一致。3、血清中Ag85A特异性抗体滴度初次免疫后Ag85A DNA质粒组小鼠抗Ag85A抗体略有增高,滴度为1:50;第二次免疫后Ag85ADNA质粒组小鼠血清中的抗体水平迅速升高,而空质粒对照组小鼠血清中Ag85A抗体始终为阴性。4、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IFN-γ的分泌水平初次免疫后,Ag85A DNA质粒组小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ水平即出现有意义的升高(P<0.01),至初次免疫后8w,Ag85A DNA质粒组小鼠IFN-γ浓度达到1400pg/ml,与其它两组差异明显(P<0.01)。空质粒对照组和正常对照组小鼠IFN-γ水平也有所增长,但二者之间没有统计学差异(P>0.05)5、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IL-4的分泌水平经过三次Ag85A DNA疫苗口服免疫,Ag85A DNA质粒组,空质粒对照组和正常对照组三组小鼠脾细胞上清中IL-4水平均未见明显增长,且浓度较低,三组之间无显著差异(P>0.05)讨论Ag85复合物是一类30-32kDa的蛋白质家族,它是结核分枝杆菌和BCG培养滤液分泌蛋白的主要成分之一,其中分泌型Ag85A蛋白可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。本实验用减毒沙门氏菌携带保护性抗原Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,重点观察口服DNA疫苗经肠粘膜摄取后血清中特异性抗体,脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4的产生情况,结果提示小鼠血清中特异性抗体水平在初次免疫后即有升高,加强免疫后升高更明显,末次免疫后抗体滴度达到了1:400,这说明口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗能有效地诱导小鼠全身性体液免疫应答。脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,且与空质粒对照组和正常对照组相比有显著性差异(P<0.01),提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗具有刺激小鼠产生抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答,这与Huygen等报道的肌注Ag85A DNA疫苗产生的结果一致。Tanghe等证明,Ag85A DNA疫苗在不同品系小鼠可诱导产生不同类型的免疫应答,其中对C57BL/6小鼠可以诱导出强烈的细胞免疫和体液免疫应答,而投给人体刺激何种类型的免疫应答尚需做进一步研究。结论1、成功构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体,并表达Ag85A蛋白,为Ag85A特异性抗体的检测和单克隆抗体的制备奠定了基础。2、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗后,有效刺激了抗Ag85A特异性抗体的产生。3、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗后脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,而IL-4含量未见升高,提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗能刺激机体产生Th1型免疫应答。