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研究目的1．了解正常人与慢乙肝患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell DC）是否具有功能上的差异，探讨慢乙肝患者体内HBV持续感染的机制。2．从细胞免疫学角度评价小柴胡片治疗前后慢乙肝病人外周血DC的抗原提呈功能的变化，并探讨打破HBV持续感染状态可能办法。3．探索HBcAg负载对DC抗原提呈能力及刺激CTL特异性活化的影响，从而尝试将HBcAg负载作为刺激慢乙肝病人DC功能恢复或上调的新办法。研究方法1．慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养：收集临床试验中出现良好临床应答的5例患者的肝素抗凝外周血，用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（PBMC），调整细胞浓度至2×106个／孔，接种于6孔细胞培养板，贴壁培养3小时后，获得单核细胞，再添加rhGM-CSF和rhIL-4终浓度分别达到100ng／ml和500U／ml，置37℃、5％CO2细胞培养箱继续培养，至第7天添加rhTNF-α，使其终浓度达到60ng／ml，继续培养至第11天，荧光显微镜下采集成熟DC的图像。收集培养的DC，运用流式细胞术检测DC表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平，并将DC与自体T淋巴细胞进行自体混合淋巴细胞反应（AMLR）鉴定DC刺激T细胞增殖的能力。2．HBcAg负载对DC刺激细胞增殖能力和CTL分泌IFN-γ水平的影响：我们引入了具有极强免疫原性的HBcAg刺激培养治疗后的慢乙肝患者DC，通过流式细胞术和自体混合淋巴细胞反应（AMLR）分析负载前后DC表面标志表达水平和刺激淋巴细胞增殖能力的变化，再利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT），分析抗原负载后DC对于CTL的活化，特别是IFN-γ的分泌水平的变化，考察慢性乙型肝炎患者治疗后临床指标的改善与机体内细胞免疫功能之间是否存在联系。3．HBcAg负载的DC对CTL应答的影响：CTL应答的强弱可以通过细胞毒性试验进行判定。我们将治疗后的慢乙肝患者DC用HBcAg负载后作为刺激细胞与自体的外周血淋巴细胞混合培养为效应细胞，以人肝癌细胞系HepG2和转染了HBV病毒的HepG2.2.1.5细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放试验（LDH释放试验）检测CTL对两种靶细胞的杀伤作用，进而评价HBcAg负载DC对CTL应答能力的作用。研究结果1．成功诱导培养出5例正常人及5例获得临床应答的慢乙肝患者外周血单核来源DC，并进行了鉴定：培养11天后，在荧光显微镜下可以看到细胞体积明显增大，胞体可见大量毛发样突起，细胞形态不规则，呈半悬浮生长状态，细胞增殖不明显，具备典型DC的形态学特征；正常人群与CHB患者的外周血DC在分子表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86的表达分别为（49.8±3.3）％VS（40.5±2.9）％、（75.0±1.2）％VS（43.3±1.9）％、（21.3±2.8）％VS（6.8±1.4）％、（56.0±1.1）％VS（72.3±3.0）％，两组间比较有显著差异（P＜0.01）；而HLA-DR则分别为（95.7±1.2）％和（96.7±1.0）％，两组间比较无显著差异（P=0.120）；正常人和CHB患者DC与自体T细胞在1：60混合比的刺激指数SI分别为（2.20±0.14）VS（1.84±0.03），两者比较有显著差异（t=5.722，P=0.000）2．CHB患者接受治疗前后CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率分别为（40.5±2.9）％VS（41.1±2.6）％、（43.3±1.9）％VS（44.1±2.0）％、（6.8±1.4）％VS（8.6±0.8）％、（72.3±3.0）％VS（73.1±2.3）％和（96.7±1.0）％VS（97.1±0.7）％，治疗前后无显著差异（P=0.748，0.488，0.122，0.543，0.503）；经HBcAg刺激的DC与无HBcAg刺激的DC相比，两者的分子表面标志表达率也基本无太大的改变，但其中的CD83的表达分别为（11.0±1.2）％和（8.6±0.8）％，两者比较有显著差异（P＜0.05）；在最适混合比培养下，正常人组与CHB治疗前、CHB治疗后（无HBcAg负载）和CHB治疗后（HBcAg负载）的DC刺激增殖SI分别为：2.20±0.14、1.85±0.03、1.95±0.03、2.06±0.02和1.95±0.03，组间比较有显著差异（P＜0.000，P＜0.005，P＜0.000）。HBcAg负载DC刺激PBLs与无HBcAg负载DC刺激PBLs均能活化较多的CTL，并分泌出较高水平的IFN-γ，5例CHB病人分别用HBcAg负载的DC刺激PBLs，均显示出强烈的刺激CTL分泌IFN-γ的作用，与无HBcAg负载的DC相比，其刺激强度有显著差异（P＜0.05）。3．5例接受治疗的CHB患者的外周血单核来源DC经过HBcAg刺激后，对于两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为（57.93±3.00）％和（77.73±3.63）％，两者间比较有显著差异（t=-16.284，P=.000）；未经HBcAg刺激的DC对两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为（47.42±2.02）％和（64.45±1.76）％，两者间比较也有显著差异（t=-24.559，P=0.000）；无HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显著差异（t=-13.527，P=0.000；t=-15.526，P=0.000）；HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显著差异（t=-3.881，P=0.001；t=-22.345，P=0.000）；5例接受治疗的CHB患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：（56.40±1.57）％VS（46.60±4.12）％、（59.17±2.64）％VS（49.20±0.46）％、（55.67±0.71）％VS（48.00±1.44）％、（58.23±1.10）％VS（46.60±0.89）％和（62.00±0.44）％VS（46.70±0.75）％，病例1经HBcAg刺激与否的自身比较无显著差异（t=2.83，P=0.104），病例2、3、4、5经HBcAg刺激与否的自身比较均有显著差异（P=0.016，0.010，0.006.0.001）；5例慢性乙型肝炎患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2.2.1.5反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：（74.67±1.29）％VS（61.90±0.60）％、（81.77±0.72）％VS（63.73±0.21）％、（74.17±1.40）％VS（64.47±0.85）％、（76.33±1.34）％VS（65.73±1.21）％和（81.70±1.45）％VS（64.40±0.70）％，5个病例经HBcAg刺激与否的自身比较均有显著差异（P=0.003，0.000，0.012.0.005，0.006）。研究结论1．CHB患者外周血DC刺激自体淋巴细胞增殖能力下降。我们认为，DC的刺激增殖能力下降与其表面黏附分子的表达下降有一定关系，可能是表面黏附分子的表达下降导致DC抗原提呈能力的下降，进而影响了DC的刺激增殖能力。提高CHB患者DC的抗原提呈能力可能有助于HBV感染者体内的病毒清除。2．慢乙肝病人接受小柴胡汤治疗前后DC的表面标志表达水平无显著差异，但治疗后的表达呈上升趋势，表明治疗后CHB患者外周血DC的黏附分子的表达得到了一定程度上调，经HBcAg刺激后CD83表达水平的上调，可能与DC的成熟度提高、抗原提呈能力的恢复有一定关系；综合表面标志表达水平、AMLR和ELISPOT的结果，我们认为，HBcAg负载可以使治疗后患者的DC抗原提呈能力得到上调或恢复，从而使DC启动的Th和CTL细胞免疫应答得到增强或恢复。3．CHB患者DC经HBcAg冲击后，能有效提呈HBcAg，诱导HBcAg特异性CTL反应。我们的实验证实，慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的DC经HBcAg抗原冲击后，能有效的诱导HBV特异性CTL。该结果为DC作为免疫佐剂进行慢性乙型肝炎免疫治疗提供了有益的实验依据。小柴胡汤作为治疗慢乙肝的有效方剂已被大量的临床及实验研究证实，其具有免疫调节作用，对多种细胞因子的调节均有影响。考虑入选本次研究的患者仅接受了小柴胡汤片剂的治疗，并未进行西医临床的抗病毒治疗，结合我们整个DC功能的实验究结果分析，可以推断，小柴胡汤片剂可能对患者外周血DC的抗原提呈功能的恢复或上调具有一定作用，因而可能使免疫功能得到一定提高。