研究背景50多年来,视网膜激光光凝治疗被应用于临床治疗各种眼底血管疾病。众多临床试验阐释了激光光凝在视网膜血管病变中的临床疗效,连续波激光主要通过激光的热损伤作用起到治疗视网膜血管疾病的作用,但激光损伤组织会造成各种并发症如激光瘢痕进行性扩大,视网膜纤维化及视网膜新生血管膜等,这均会导致中心暗点及视力下降。为了减少激光能量对视网膜组织造成的损伤,我们提倡侵入性更少的治疗策略。激光技术的进步推动选择性激光光凝的发展,1990年Pankratov首次报道微脉冲激光(micropulse laser, MPL)治疗模式,与连续波激光不同,它是以一系列短脉冲进行传导的,由于脉冲间有较长的间歇时间,激光热量不容易堆积,因而视网膜不产生可见损伤。1997年Friberg等报道810nm微脉冲激光治疗糖尿病黄斑水肿(Diabetic Retinopathy Edema, DME)的临床应用。以后几项临床试验也已证实阈值下微脉冲激光治疗DME可与ETDRS激光光凝一样有效或更优。糖尿病常常并发糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR),它是最重要的可预防性致盲眼病之一,1/10糖尿病患者受到DME或增殖性糖尿病性视网膜病变(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR)的威胁。抗新生血管生成因子(anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF)药物成为现今治疗DME及PDR的主要方法。然而抗VEGF药物治疗价格昂贵,且需要长年累月重复治疗以得到或保持理想疗效。另外多次玻璃体腔内注射会增加眼内炎发生概率,而眼内炎的发生往往是灾难性的。DME主要是由于血-视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)功能的破坏所致,而PDR则由于视网膜新生血管形成所致,两者的发生均与新生血管生成相关。RPE层细胞可产生VEGF及色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)等血管生成调节因子,VEGF能够促进血管生成,而PEDF则相反,它可使血管内皮细胞的增殖抑制,使毛细血管内皮功能稳定,从而达到抑制血管生长的作用。目前关于视网膜血管疾病的发病机制认为RPE产生的潜在细胞因子及细胞外血管因子是视网膜疾病比如DME的主要调节介质。研究发现810nm微脉冲半导体激光对视网膜色素上皮层(Retinal pigment epithelium, RPE)具有专一性,它可以通过作用于细胞内光受体来调节病理状态如糖尿病的细胞活性,而对神经视网膜及脉络膜几乎不造成影响。多项临床试验报道了810nm微脉冲激光可有效治疗DME及PDR,而我们前期的体外细胞实验研究也发现阈值下810nm微脉冲半导体激光在亚致死模式下对RPE细胞分泌血管生长调节因子的水平进行调节。基于以上分子水平研究结果及临床试验结果,本研究试图以阈值下810nm微脉冲激光刺激糖尿病棕色挪威(Brown Norway, BN)大鼠视网膜,观察VEGF和PEDF表达水平的变化以及微脉冲激光刺激后大鼠眼底血管荧光造影(fluorescein angiography, FFA)的改变,从而进一步探讨阈值下810nm微脉冲激光对糖尿病大鼠RPE层分泌细胞因子的调节作用及治疗糖尿病性视网膜病变的分子机制。研究目的本研究旨在探讨：1.阈值下810nm微脉冲激光刺激BN大鼠视网膜时不引起损伤性光斑的激光参数；2.阈值下810nm微脉冲激光刺激BN大鼠视网膜RPE层对其分泌VEGF及PEDF的调节作用；3.阈值下810nm微脉冲激光刺激糖尿病大鼠视网膜后眼底血管荧光造影的改变。研究方法1、实验分组36只10周龄健康清洁雄性棕色挪威(BN)大鼠,体质量280-320g,由北京维通利华动物有限公司提供(许可证号：SCXK(京)2012-0001)。随机抽取6只用于探索无损伤激光斑的阈值下810nm微脉冲激光的参数。其余30只采用随机数字表法将大鼠随机分为4组。正常对照组2只(A1组),腹腔注射0.1ml/L枸橼酸纳溶液正常饲养2月后不给予任何干预；正常大鼠微脉冲激光组10只(A2组),腹腔注射0.1ml/L枸橼酸纳溶液正常饲养2月后给予微脉冲激光照射双眼；糖尿病对照组3只(A3组),通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型予高糖饮食饲养2月后不给予干预；糖尿病大鼠微脉冲激光组15只(A4组),通过腹腔注射STZ建立糖尿病模型予高糖饮食饲养2月后予微脉冲激光照射双眼。2、探索810nm微脉冲激光刺激BN大鼠视网膜时不产生激光斑的激光参数腹腔内注射水合氯醛(10%,3.5ml/kg)麻醉6只大鼠,双眼复方托吡酰胺散瞳。其中1鼠作连续波激光对照,以532nm激光、100μm光斑、0.2s曝光时间、200mW功率围绕大鼠视盘等距离刺激双眼视网膜9个点,尽量避开大血管,其余5只鼠分别以不同激光功率(400mW,600mW,800mW,1000mW,1200mW), 100μm光斑、0.2s包络时间、100Hz、10%负载系数围绕大鼠视盘等距离刺激双眼视网膜9个点,尽量避开大血管。激光照射后即刻拍摄眼底彩色照片。3、糖尿病动物模型的建立B1、B2组大鼠禁食12h后,将STZ溶解于O.lmol/L枸橼酸纳溶液(PH 4.5),按60mg/kg一次性腹腔注射后每天以高糖饮食饲养。A1、A2组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸钠溶液。注药72h后测空腹血糖,大于16.7mmol/L者定为糖尿病模型大鼠。B1、B2组大鼠饲养2月后予麻醉行眼底血管荧光造影(FFA)检查视网膜情况。4、实验干预及检测将A2组大鼠及B2组大鼠分别随机分成5个激光功率治疗小组,以810nm微脉冲激光行全视网膜光凝,激光参数为100μm光斑,0.2s包络时间,10%负载系数,功率分别为400mW、600 mW、800 mW、1000 mW、1200 mW.微脉冲激光照射后24h后,随机于每组大鼠取1只过量麻醉处死后,取视网膜-RPE-巩膜复合体制作RIPA裂解液视网膜匀浆组织,以RT-PCR检测VEGF及PEDF mRNA水平,以蛋白免疫印迹法(western-blot)检测其VEGF及PEDF因子蛋白表达水平。5、微脉冲激光刺激后行FFA检查微脉冲激光照射后2周、1个月麻醉余下大鼠,腹腔注射10%荧光素钠注射液0.3m1,即刻行FFA检查。6、统计学方法统计分析采用SPSS 19.0统计学软件(美国IBM SPSS Statistic公司)。数据结果根据正态性检验以后以均数±标准差(x±s)或中位数表示。两组间均数比较进行两独立样本t检验或非参数检验。多组间均数比较进行LSD单因素方差分析。P<0.05有统计学差异。研究结果1、不同功率微脉冲激光刺激大鼠视网膜的可见激光光斑情况连续波532nm激光围绕大鼠视盘等距离刺激9个点,可见9个白色光斑,而810nm微脉冲激光刺激时当激光功率为600mW及以下时,双眼均未见灰白色光斑,而功率在800mW及以上时,开始出现激光光斑,且随激光功率的升高,可见光斑也越多。2、糖尿病动物模型造模情况糖尿病组大鼠造模后第1天观察大鼠尿量明显增多,72小时后空腹血糖大于16.7mmol/L者有14只(14/18),B1组2只,B2组12只,造模成功率达77.8%。造模成功大鼠高糖饲养2个月后行FFA检查发现8只(8/14)有局限性或弥漫性视网膜荧光素渗漏,但均未见临床糖尿病性视网膜病变患者所出现的视网膜微动脉瘤、硬性渗出或黄斑水肿等情况。3、A1与B1组大鼠VEGF与PEDF蛋白水平差异A1组大鼠VEGF/β-actin为0.153±0.011,B1组大鼠VEGF/β-actin为0.429±0.051,两者间有显著统计学差异(t=-12.865,P=0.000)。4、不同能量微脉冲激光照射下视网膜组织VEGF与PEDF蛋白及其mRNA水平正常大鼠或是糖尿病大鼠接受微脉冲激光刺激后VEGF均比对照组下降,且有统计学差异(F=38.373,p=0.000；F=13.69,p=0.000)；PEDF比对照组上升,且有统计学差异(F=27.771,p=0.000；F=5.966,p=0.001)。随激光功率升高,VEGF表达量逐渐下降,PEDF表达量逐渐升高,当功率为600-800mW时VEGF达到最低值,PEDF达到较高值,而当激光功率继续升高时,VEGF蛋白又有升高趋势,而PEDF蛋白有下降趋势。而VEGF与PEDF的mRNA水平与其蛋白水平呈大致一致的变化趋势。5、B1与B2组大鼠间视网膜FFA结果差异B1、B2组大鼠干预前眼底FFA图像均显示后极部视网膜荧光渗漏,B1组大鼠不接受微脉冲激光刺激,于实验第2周、1个月时视网膜荧光渗漏加重,呈弥漫性片状渗漏,而B2组以600mW微脉冲激光刺激后第2周、1个月视网膜渗漏明显减轻。结论1.10%负载系数的810nm微脉冲激光功率在600mW以内时刺激BN大鼠视网膜不产生可见激光斑；2.阈值下810nm微脉冲激光刺激BN大鼠视网膜可使RPE层分泌VEGF减少,PEDF增多；3.阈值下810nm微脉冲激光刺激糖尿病大鼠视网膜后可使视网膜血管荧光渗漏减轻。