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PRR11是本课题组自主研究发现的一个新的肿瘤相关基因,前期研究发现PRR11基因呈现细胞周期依赖的规律性表达特征,同时在细胞周期和肺癌等恶性肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。但到目前为止,PRR11在细胞周期进程和肺癌等恶性肿瘤的发生发展过程的具体分子机制仍不清楚,有待深入研究。本研究采用酵母双杂交技术,对PRR11的相互作用蛋白进行了初步的系统筛选和初步分析。(1)采用酵母双杂交技术筛选PRR11的相互作用蛋白首先,我们构建用于酵母双杂交筛选的PRR11诱饵质粒并检测其自激活作用,发现PRR11具有自激活作用,进一步构建突变体获得具有较低自激活作用的突变体。采用酵母双杂交系统对人胎脑cDNA文库进行筛选,获得102个初始阳性克隆转化子。经LacZ报告基因检测,排除假阳性克隆和重复克隆,将阳性克隆锁定至39个。通过测序和序列比对分析,证实这39个克隆属于编码15种不同蛋白的基因。最终有RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13四个蛋白通过回转验证。最终确定了有RNF41等四个蛋白是PRR11的候选相互作用蛋白。(2)PRR11与RNF41相互作用的初步鉴定构建了PRR11与RNF41的过表达载体,瞬时共转染293Ta和A549细胞,采用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术进一步验证确认PRR11与RNF41间的相互作用。免疫共沉淀结果表明PRR11与RNF41在细胞内相互结合;免疫荧光结果发现PRR11与RNF41在细胞内共定位,且定位于细胞质。这些结果提示PRR11与RNF41存在相互作用。(3)PRR11和RNF41过表达对STAT3信号通路的影响在肺癌细胞A549中分别转染PRR11与RNF41过表达质粒,同时联合IL-6处理,采用Western Blot和定量RT-PCR技术检测PRR11和RNF41过表达对STAT3信号通路的影响。Western Blot结果表明过表达PRR11和RNF41增强STAT3在Tyr705位点的磷酸化,定量RT-PCR结果显示IL-6处理后STAT3的下游靶基因如SOCS3、C-MYC和PIM1等发生显著上调或下调,但PRR11和RNF41过表达并没有进一步增强这些STAT3靶基因的上调或下调。同时,采用BrdU标记和划痕实验检测细胞增殖与迁移能力,结果表明IL-6联合PRR11和RNF41过表达处理可显著促进肺癌细胞A549的增殖和迁移。这些结果表明,PRR11和RNF41可增强STAT3通路激活并由此促进肺癌细胞的增殖与迁移。综上,本研究应用酵母双杂交技术筛选出了多个PRR11的潜在相互作用蛋白,并初步证实PRR11与RNF41存在相互作用。PRR11和RNF41促进肺癌细胞的STAT3磷酸化激活以及细胞增殖与迁移,但对STAT3下游靶基因转录没有显著影响。本研究为进一步深入探讨PRR11调控STAT3通路的分子机制奠定了基础,将为肺癌分子诊断和靶向治疗提供新的依据。