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目的心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤指发生于心肌梗死后,血流再灌注时出现心肌损伤加重的现象。心肌I/R损伤是心功能障碍和心肌细胞死亡的主要原因。非编码RNA广泛参与调控心肌I/R损伤介导的心肌细胞凋亡过程,而环状RNA(Circular RNAs,circRNAs)作为结构稳定、表达丰度高的一类非编码RNA,其潜在参与心肌I/R损伤的分子机制目前尚不完全清楚。探索心肌I/R损伤的潜在新病理机制,预防、减少心肌I/R损伤是目前临床亟待解决的重要问题。实验方法第一部分:提取大鼠乳鼠原代心肌细胞,采用心肌肌钙蛋白T(cTnT)抗体,应用细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)方法鉴定SD大鼠心肌细胞。随后,对原代心肌细胞进行体外I/R处理,采用实时定量PCR(qPCR)方法检测 circ-RHOJ.1、miR-124-3p 和神经调节蛋白 1(neuregulin-1,NRG-1)的 RNA表达水平;同时,使用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)和IF法检测NRG-1的蛋白表达水平与细胞定位。进一步构建大鼠体内心肌I/R损伤模型,提取心肌细胞与处理心脏组织,再次采用qPCR验证circ-RHOJ.1、miR-124-3p与NRG-1的RNA表达水平;同时,应用心脏组织免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)染色评估NRG-1在心肌I/R损伤组织中的蛋白表达水平。第二部分:采用生物信息学预测miR-124-3p与circ-RHOJ.1以及miR-124-3p和NRG-1的潜在结合位点,应用双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-124-3p与circ-RHOJ.1 以及 miR-124-3p 和 NRG-1 的相互作用。第三部分:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)方法和流式细胞术检测过表达circ-RHOJ.1和应用miR-124-3p抑制剂对心肌I/R损伤后心肌细胞增殖活性和凋亡率的影响。同时,采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测细胞因子IL2、IL6、IL10和TNF-α表达水平,从而评估炎症反应的程度。实验结果第一部分:大鼠乳鼠提取的原代心肌细胞高表达cTnT,此方法能成功分离心肌细胞。大鼠原代心肌细胞体外I/R处理后表达circ-RHOJ.1的RNA水平与NRG-1的mRNA和蛋白水平显著下调,而miR-124-3p的RNA表达水平显著升高。而且,体内心肌I/R损伤的模型提取的心肌细胞,circ-RHOJ.1、miR-124-3p和NRG-1的表达与体外心肌细胞I/R损伤后的表达模式相符。第二部分:生物信息学软件预测miR-124-3p与circ-RHOJ.1以及miR-124-3p和NRG-1分别具有1个潜在的结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示miR-124-3p 能分别与 circ-RHOJ.1 和 NRG-1 结合。Circ-RHOJ.1 可以作为miR-124-3p的海绵体,NRG1是miR-124-3p的靶基因。第三部分:过表达Circ-RHOJ.1或抑制miR-124-3p的表达可显著增加心肌I/R损伤后抗炎因子IL10和减少促炎因子IL2、IL6和TNF-α在损伤心肌细胞中的表达水平。功能学实验结果显示,抑制miR-124-3p的表达或过表达circRHOJ.1可以增强心肌I/R损伤后心肌细胞的增殖活性,抑制心肌细胞凋亡。结论Circ-RHOJ.1可以增强心肌I/R损伤后的心肌细胞的增殖活性,并抑制心肌细胞的凋亡;其机制是通过竞争性抑制miR-124-3p调控NRG-1表达。Circ-RHOJ.1可以作为心肌I/R损伤的分子标志物。