灵芝是我国传统的中药材,具有补气安神,止咳平喘等功效,现代研究表明多糖和三萜类成分是灵芝中的主要活性成分,具有提高免疫细胞活性和抑制肿瘤细胞增殖等作用。当前关于灵芝的研究主要集中在其功能疗效和活性机理方面,而对灵芝生长发育过程中木质纤维素基质如何转化,以及子实体不同发育阶段活性成分积累、变化规律等研究甚少。因此,本论文拟研究一株孢子粉高产灵芝(Ganoderma lucidum)菌株G0119在营养生长与子实体发育不同时期木质纤维素基质降解、糖类含量变化和三萜积累的规律,并结合基因组、转录组等研究手段解析灵芝基质木质纤维素降解、糖类代谢规律与三萜代谢的分子机制,明确灵芝木质纤维素基质转化、糖代谢与萜类积累的内在联系,旨在为灵芝科学采收及定向获取活性物质提供理论依据和实践指导。论文主要研究结论如下:(1)灵芝不同发育期基于木质纤维素降解的糖代谢变化规律与其他灵芝菌株及模式木腐菌基因组的碳水化合物活性酶基因相比,灵芝G0119具有更多的半纤维素、纤维素降解的同工酶基因。不同生长阶段的转录组与蛋白质组学研究结果显示:灵芝子实体不同发育阶段基质中木质纤维素显著降解,且与糖代谢密切相关。如从菌丝期至原基期,半纤维素酶基因与木质素酶基因的表达水平相对较高,而纤维素降解酶的表达开始启动,基质中木质素含量由22.54%下降至19.08%,纤维素含量由21.24%下降至16.71%,半纤维素含量由13.86%下降至11.49%,同时EMP、HMP和TCA糖类分解代谢启动,基质中葡萄糖含量在菌丝期由0.41%显著上升至1.43%,并在原基形成时下降,表明基质中木质素结构屏障被破坏后,半纤维素及纤维素被降解,葡萄糖等降解产物进入胞内代谢,为子实体的发育提供能量、还原力及碳源物质。从原基期至子实体初期,纤维素酶和半纤维素酶基因表达继续上调,并且与糖类分解代谢酶以及海藻糖、阿拉伯糖醇合成酶的表达成正相关。纤维素和半纤维素含量继续下降至16.71%和11.49%,糖类分解代谢以EMP与TCA为主,HMP为辅。与此同时,基质中葡萄糖含量下降至0.52%,海藻糖、阿拉伯糖醇及糖原的合成代谢酶表达相应上调,表明进入胞内的糖类进行分解代谢的同时,也开始进行糖类合成代谢。相应的海藻糖、糖醇和多糖含量分别达到1.71%,0.32%和1.81%,持续上升的海藻糖、糖醇、多糖,既可起到抗逆、稳定渗透压等生理作用,也为后期的代谢储备碳源。从子实体成熟至产孢完成期,大量纤维素酶基因表达显著上调,并且与几丁质合成酶的表达成正相关,基质中纤维素含量下降至12.67%,葡萄糖含量下降至0.24%,不仅TCA等糖类分解代谢保持在较高水平,而且海藻糖及多糖的合成酶表达显著下调,前期积累的糖原显著下降,甘露醇和海藻糖含量下降至0.04%和0.03%。伴随着糖类分解,几丁质合成酶的表达水平持续上升,表明子实体成熟及大量产孢等生理活动使得更多来自于纤维素基质及前期储存的碳源进入分解代谢,以满足能量及细胞碳骨架结构合成的需求。(2)基于木质纤维素降解与糖代谢的萜类合成代谢特征灵芝不同生长发育时期萜类的合成代谢始于糖类分解代谢的核心代谢产物乙酰CoA。如从菌丝期至原基期,参与经乙酰CoA合成三萜上游代谢途径前体甲羟戊酸的ACAT、HMGS和HMGR表达水平较高,弱极性三萜开始积累,且其含量变化与纤维素酶和糖类分解代谢酶的表达成正相关。从原基期至子实体初期,纤维素酶与半纤维素酶的表达上调与糖类分解代谢酶表达成正相关,并伴随着EMP和HMP代谢上调以及强极性三萜的含量上升,其中EMP代谢上调可为三萜上游代谢途径中甲羟戊酸前体合成提供乙酰CoA,HMP代谢上调所产生的NADPH可增强三萜上游代谢酶HMGR的活性,意味着纤维素、半纤维素的降解为基于糖代谢的萜类上游中间体合成提供物质基础,因此促进了三萜前体合成。发现4个CYP基因与前体羊毛甾醇合成酶基因表达正相关,1个CYP基因的表达与强极性三萜的含量变化成正相关,该基因在原基期至子实体初期表达显著上调,此时萜类合成下游分支代谢以强极性三萜合成为主,强极性三萜含量达到最高水平,其中灵芝酸B达到1.98‰,同时弱极性三萜含量也逐步上升,伴随着海藻糖、阿拉伯糖醇及糖原的合成代谢酶表达上调和相应糖类的含量上升,海藻糖和阿拉伯糖醇含量上升至1.71%和1.42%。从子实体成熟至产孢完成期,强极性三萜含量显著下降,其中灵芝酸B下降至0.33‰,且强极性三萜的含量下降与三萜上游代谢酶MPK的表达下降成正相关,与纤维素酶、糖原分解代谢酶的表达成负相关,反映出这一时期的强极性三萜合成代谢减弱;另发现3个CYP基因表达与弱极性三萜的含量变化成正相关,且在这一时期表达处于较高水平,意味着萜类合成下游分支代谢由强极性三萜合成转向弱极性三萜合成,弱极性三萜含量显著提高,其中灵芝酸T含量达到1.26%,且与纤维素酶的表达成正相关,与糖原合成代谢酶的表达成负相关,该时期糖原显著下降,纤维素和海藻糖含量分别下降至12.67%和0.25%左右,表明此时纤维素降解和储备碳源分解不仅为子实体成熟及产孢提供能量与碳源,同时也为弱极性三萜类的合成提供了物质基础。(3)活性成分三萜的时空分布变化灵芝子实体发育不同时期三萜类组份和含量差异较大,呈现出强极性三萜含量逐步下降,弱极性三萜含量持续上升的趋势,反映在子实体发育时三萜的下游分支代谢存在从强极性三萜代谢向弱极性三萜代谢转换。不同种类三萜的分布部位不同,子实体发育过程中,强极性三萜主要分布在子实体的菌盖和菌柄部位,而菌柄以下的菌基部位只含有弱极性三萜,表明发育过程中的灵芝菌盖和菌柄较菌基中存在更多的三萜下游合成分支途径。综上所述,本论文研究不仅揭示了灵芝不同发育时期木质纤维素降解与糖代谢,继而与三萜类上游前体合成及其下游分支代谢转换的内在联系,而且基于对三萜类及灵芝活性成分的分布规律解析,为建立一种可以定向获得高活性成分的新采收方式提供了可能:即在灵芝子实体刚开伞的发育初期进行采收,获得具有高含量强极性三萜的灵芝子实体,在最终采收时期采收灵芝菌基部位以获得高含量的弱极性三萜。采用多次采收,总采收量将高于一次采收成熟子实体的常规方式的采收量。相关研究为定向高效获取灵芝活性成分提供了科学依据,具有重要的科学与应用价值。