论文部分内容阅读
目的: CD4+CXCR5+ICOS+T细胞是一群独特的CD4+T细胞，在协助B细胞增殖、分化和发育中发挥重要作用。近年来大量研究表明，CD4+CXCR5+ICOS+T细胞发育、分化异常，可引起机体内产生大量自身免疫性抗体，促使机体出现免疫缺陷，导致自身免疫病的发生。在类风湿关节炎(RA)患者滑膜组织中，成纤维样滑膜细胞(FLS)过度增生，是导致炎症与骨破坏的主要原因，FLS与T细胞相互作用可进一步促进FLS激活及T细胞招募，加剧滑膜炎症，然而FLS是否通过影响CD4+CXCR5+ICOS+T细胞的产生，进而参与RA的炎症反应至今尚不清楚。在本研究中，旨在探讨RA患者FLS对其外周血CD4+CXCR5+ICO S+T细胞的调控作用。 方法: (1)采用胶原酶消化法分离RA患者FLS，同时分离RA患者外周血单个核细胞(PBMC)，加入anti-CD3(浓度3μg/ml)、anti-CD28（浓度2μg/ml）抗体刺激同时与或不与FLS共培养72h，收集悬浮细胞，流式细胞仪检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率，RT-PCR方法检测PBMC中IL-21、Bcl-6mRNA表达;(2)收集培养72h后细胞上清，蛋白芯片技术检测上清中分泌细胞因子变化，同时采用ELISA方法检测上清中IL-6、IL-12水平;在共培养体系中分别加入anti-IL-6R拮抗剂、anti-IL-12R拮抗剂，流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率，RT-PCR方法检测PBMC中IL-21、Bcl-6mRNA水平;(3)流式细胞术及免疫荧光法检测PBMC及FLS细胞内ROS表达，在共培养体系中加入ROS拮抗剂NAC，ELISA方法检测上清中IL-6水平，流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率，RT-PCR方法检测PBMC中IL-21、Bcl-6mRNA水平;(4)收集细胞培养上清，ELISA方法检测上清中TNF-α、IL-1β水平，在共培养体系中分别加入anti-TNFR2拮抗剂和anti-IL-1βR拮抗剂，流式细胞术及免疫荧光法检测PBMC及FLS细胞内ROS表达，ELISA方法检测上清中IL-6水平，同时采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率，RT-PCR方法检测PBMC中IL-21、Bcl-6mRNA表达。 结果: 1.与单独PBMC相比，在PBMC与FLS共培养72h后，RA患者外周血中CD4+CXCR5+ICOS+T细胞产生明显增多(20.13％±1.83％/21.00％±2.13％vs.12.07％±1.33％，P＜0.001)，同时细胞培养上清中IL-21水平升高(77.18±7.19/78.12±8.36vs.67.74±7.71pg/ml,P＜0.05),PBMC中IL-21和Bcl-6mRNA表达增多(均P＜0.001);2.蛋白芯片及ELISA结果表明，在PBMC与FLS共培养体系中，细胞培养上清中IL-6和IL-12水平均明显升高(1260.6±375.47vs.1925.4±410.67pg/ml,P＜0.01,183.83±59.12vs265.47±70.75pg/ml,P＜0.05);在共培养体系中加入anti-IL-6R拮抗剂后，CD4+CXCR5+ICO S+T细胞比例明显下降(20.31％±1.22％vs.15.1％±1.81％，P＜0.001)，而加入anti-IL-12R拮抗剂CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比率无明显变化(19.61％±1.27％vs.18.69％±0.93％，p=0.082);3流式细胞术及免疫荧光结果显示，在PBMC与FLS共培养体系中，PBMC与FLS细胞内ROS表达均明显增多(P＜0.01，P＜0.001)，且在共培养体系中加入NAC后，细胞培养上清中IL-6水平及CD4+CXCR5+ICO S+T细胞比例明显下降(1773.5±165.18vs.1147.70±214.93pg/ml，P＜0.001;20.14％±1.07％vs.13.63％±1.39％，P＜0.001);4.ELISA结果显示，在PBMC与FLS共培养体系中，细胞培养上清中TNF-α、IL-1β水平显著升高(143.03±21.02vs179.76±18.17vs.149.58±27.51pg/ml,P＜0.01,P＜0.05)(117.32±11.31vs.172.20±20.45vs.104.47±20.38pg/ml，P＜0.001，P＜0.001)，在培养体系中分别加入anti-TNFR2拮抗剂、anti-IL-1βR拮抗剂以后，PBMC与FLS细胞内ROS表达、细胞培养上清中IL-6水平及CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例均明显下降(P＜0.05;P＜0.001)(1632.21±226.71vs.1165.48±240.20pg/ml,P＜0.05);1649.86±260.399vs.1036.94±162.51pg/ml,P＜0.05)(22.28％±1.30％vs13.41％±1.08％,P＜0.001,22.39％±1.40％vs15.14％±1.50％,P＜0.001)。 结论: RA患者FLS可能通过IL-6促进外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞产生;同时，ROS水平升高可导致IL-6增多，提示缺氧环境可能促进CD4+CXCR5+ICOS+T细胞产生。