副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)属于革兰氏阴性嗜盐弧菌，是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛存在于江河口及海洋环境中，是鱼、虾、贝类等养殖水产动物的重要病原菌，给养殖业带来巨大的经济损失。同时，副溶血弧菌也是一种食源性致病菌，容易引起食物中毒，严重的可引起肠胃炎等疾病。此外，副溶血弧菌还可能引发伤口感染，严重的可导致败血症甚至死亡。因此对副溶血弧菌的研究已引起全世界的关注。以往对副溶血弧菌的预防和治疗主要是依靠抗生素和化学药物，由于长期大量不合理使用，已引起弧菌的抗药性，不仅造成水体的污染，而且引起抗生素和其他药物在动物体内的富集，对人类健康造成危害。因此，寻找一种更加安全有效的防治副溶血弧菌的方法十分重要。目前很多研究表明外膜蛋白在细菌致病性和免疫性中发挥着重要的作用，并且证明外膜蛋白是良好的免疫原，可以加快巨噬细胞对抗原的递呈作用，激活淋巴细胞增殖反应，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，从而抵抗同源菌和异源菌的攻击，对机体自身有一定的保护性。研制外膜蛋白相关的疫苗，开展免疫防治是预防细菌性疾病的重要手段。因此本课题以副溶血弧菌为研究对象，运用蛋白质组学技术及免疫学技术筛选和鉴定具有强保护性的外膜蛋白。具体研究内容如下：1.用灭活的副溶血弧菌免疫小鼠，并加强免疫4~5次，获得全菌抗血清，经Dot-Blot法检测抗血清对外膜蛋白的效价为1:5000。2.利用十二烷基肌氨酸钠抽提并结合超速离心的方法提取副溶血弧菌外膜蛋白，外膜蛋白样品经SDS-PAGE和Western Blot分析，有12个外膜蛋白具有免疫原性，其中10个外膜蛋白经MALDI-TOF/TOF质谱加以鉴定，蛋白种类分别为LPS-assembly protein LptD，VP0802，Maltoporin，Chitoporin，OmpC，OmpA，OmpU，OmpK，VP1243，VP0966。其中，OmpU，OmpK，OmpC及OmpA已经被证实与免疫原性相关，LPS-assembly protein LptD，Maltoporin，Chitoporin，VP0802，VP1243，VP0966在本实验中首次被确定为免疫原性蛋白。3.为了进一步证实蛋白VP0802的免疫原性，在本实验中提取副溶血弧菌基因组DNA，扩增目的基因VP0802，构建重组质粒pET-28a(+)-VP0802，将重组质粒pET-28a(+)-VP0802转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得VP0802蛋白的高表达菌株，并得到纯化的蛋白VP0802。利用蛋白VP0802免疫小鼠，加强免疫4~5次，获得抗血清，经Dot-Blot法检测抗血清对蛋白VP0802的效价为1:5000，由此证明蛋白VP0802具有免疫原性。在本课题中，寻找到多种副溶血弧菌免疫原性外膜蛋白，并对蛋白VP0802克隆，构建该蛋白的高表达菌株，从而获得具有强保护性的副溶血弧菌外膜蛋白抗原，为筛选具有较高免疫保护作用的多价疫苗候选靶位和控制弧菌感染提供免疫学参考，为研制开发亚单位疫苗候选靶位奠定理论基础。这为更好的预防和治疗由副溶血弧菌引起的细菌性疾病提供依据，对海水养殖鱼类疾病的防治具有重要的理论意义和实用价值。