D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达及固定化

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D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位置的差向异构体,是一种稀有糖,被广泛应用于食品、医药、保健品等领域。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase,EC5.1.3.30)是异构化D-果糖合成D-阿洛酮糖的关键酶。DPEase种类繁多,但大多数热稳定性较差,最适反应环境偏碱性,其中Dorea sp.CAG:317来源的DPEase耐酸碱能力较强,Clostridium cellulolyticum H10来源的DPEase热稳定性较好。本研究首先将上述两种DPEase在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分别表达,分析了其酶学性质,构建了两种酶串联共表达菌株,再通过启动子组合优化提高DPEase共表达水平,最后使用二氧化钛、海藻酸钠、戊二醛进行固定化细胞,并做了固定化细胞条件优化与性质分析,为DPEase在工业生产中应用提供理论依据。(1)设计引物分别克隆了Dorea sp.CAG:317和C.cellulolyticum H10微生物的DPEase基因片段,构建了重组菌株B.subtilis 168/pMA5-Ds-dpe、B.subtilis168/pMA5-Rc-dpe,摇瓶培养24 h后成功表达目的蛋白,收集细胞提取粗酶液,对DPEase分别进行分离纯化,研究其酶学性质。DSDPEase最适反应温度为60℃,不耐高温,在45℃半衰期小于1 h,RCDPEase最适反应温度为70℃,在65~75℃温度范围内相对酶活力保持在90%以上,热稳定性较好,在45℃半衰期超过4 h。两种DPEase最适反应pH均为8.5,而耐酸碱性能DSDPEase则优于RCDPEase。实验证明pH 6.5的环境下酶催化单糖的反应液不易发生褐变OD420为0.114,pH 8.5的反应溶液褐变程度较深其OD420为0.261和0.259。(2)首先构建双顺反子重组菌株B.subtilis 168/pMA5-Ds-Rc-dpe和B.subtilis168/pMA5-Rc-Ds-dpe共表达DSDPEase和RCDPEase,检测上述重组菌株粗酶液在pH6.5的酶活分别为18.9 U·mL-1、17.5 U·mL-1,均超过了单酶表达的酶活。通过酶活的比较,择优确定DSDPEase、RCDPEase基因的前后顺序为5’-Ds-Rc-dpe-3’。(3)构建双启动子重组表达载体,首先以pMA5自身携带的PHpa II为第一启动子选择PHpa II、P43、PsrfA、PspoVG分别为第二启动子构建重组菌B.subtilis168/pMA5-Ds-dpe-PHpa II-Rc-dpe、B.subtilis 168/pMA5-Ds-dpe-P43-Rc-dpe、B.subtilis168/pMA5-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe、B.subtilis 168/pMA5-Ds-dpe-PspoVG-Rc-dpe,摇瓶发酵后,DPEase均能成功表达,测定其粗酶液在pH 6.5条件下的酶活,B.subtilis168/pMA5-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe的酶活力最高,达到154.43 U·mL-1是单酶表达酶活的9倍。然后以PsrfA为第二启动子,置换第一启动子,构建重组菌B.subtilis168/pMA5-PspoVG-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe、B.subtilis 168/pMA5-P43-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe,SDS-PAGE分析结果表明B.subtilis 168/pMA5-PspoVG-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe可成功表达DPEase,但在33 k Da处B.subtilis 168/pMA5-P43-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe泳道未出现明显的特异性条带,在pH 6.5条件下B.subtilis 168/pMA5-PspoVG-Ds-dpe-PsrfA-Rc-dpe酶活力为228.5 U·mL-1,较单酶表达总酶活提到了13.7倍。(4)向传统固定化材料海藻酸钠中添加适量二氧化钛明显提高了固定化细胞的酶活回收率和机械强度,固定化细胞条件优化结果为海藻酸钠浓度2%,细胞包埋量60g·L-1,TiO2添加量1:4(TiO2:SA),CaCl2溶液浓度2%,Glutaraldehyde浓度为0.03%。该条件下固定化细胞酶活回收率为82%,固定化细胞最适反应温度为80℃,热稳定性提高,连续操作10批次,酶活回收率保留58%,机械强度保持100%,转化率保持在28.8%,残余酶活为70.5%。
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