川芎—天麻配伍效应成分血脑屏障透过性相互作用研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:cexo0924
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目的:川芎-天麻为古今治疗偏正头痛的常用药对,但针对不同的病因其配伍剂量有不一同的变化,其效应成分主要分别为川芎嗪、天麻素及天麻苷元等。本论文在前期对药材效应成分含量相互影响的研究基础上,进一步采用人脑毛细血管内皮细胞系HCMEC/D3建立体外血脑屏障模型,运用多种方法对模型进行鉴定。模型构建成功后分别加入药对效应成分川芎嗪、天麻素及天麻苷元,测定透过率以研究川芎-天麻效应成分单独使用的血脑屏障透过性及共同使用后是否会对血脑屏障透过性相互造成影响,评价药对的效应成分透血脑屏障能力的异同及相互作用,旨在为临床使用该药对提供依据。方法:(1)HCMEC/D3细胞培养细胞接种于Transwell上层小井微孔膜,培养至镜下观察基本无明显大面积空白后进行实验;(2)跨膜细胞电阻值测定细胞接种后测定不同时间点的跨膜细胞电阻值(TEER)并作出TEER时间曲线,初步确定屏障形成;(3)紧密连接蛋白表达取培养不同时间的细胞悬液,提取总蛋白,Western blot检测紧密连接蛋白Claudin-5、Z0-1及Occludin表达量并与参照细胞(人脐静脉内皮细胞HUVEC)进行对比,以确定血脑屏障是否成功形成紧密连接;(4)屏障的初步评价用试漏实验对已建立的血脑屏障进行评价,比较不同时间液面差值以确定屏障是否致密;(5)屏障对亲水性小分子的限制透过性研究于上层小井加入荧光素钠,于一定时间后取下层接收液测定荧光素钠浓度并计算表观渗透系数Papp,研究屏障是否具有限制亲水性小分子透过的能力;(6)川芎嗪的血脑屏障通透性及天麻效应成分对其影响的研究于上层小井分别加入相同浓度的川芎嗪及不同浓度的天麻素或天麻苷元,于不同时间点取下层接收液,建立LC/MS/MS法测定川芎嗪含量并计算透过率及进行组间比较,研究天麻素或天麻苷元是否会影响川芎嗪的血脑屏障透过性;(7)天麻苷元的血脑屏障通透性及川芎嗪对其影响的研究于上层小井分别加入相同浓度的天麻苷元及不同浓度的川芎嗪,于不同时间点取下层接收液,建立HPLC法测定天麻苷元含量并计算透过率及进行组间比较,研究川芎嗪是否会影响天麻苷元的血脑屏障透过性。结果:(1)形态学观察显示,状态良好的HCMEC/D3呈梭形,培养3-4天后即可见细胞密集,镜下无明显大面积空隙,可初步证明细胞已于微孔膜上长满;(2)跨膜电阻值测定结果显示,TEER值随时间推移逐渐增加,至第六天时不再有明显增长且基本进入稳定状态,可持续至第十天无明显波动,可初步认为模型第六天建成;(3)Western blot 结果表明:Claudin-5、Z0-1 与 Occludin 在 HCMEC/D3 与 HUVEC均有表达且三种紧密连接蛋白的表达量均高于培养相同时间的对照细胞,Claudin-5与Z0-1于第六天表达量达到稳定状态,Occludin表达量于10天内无明显变化,综合考虑,可认为模型于第六天建成;(4)培养六天后,试漏实验合格,4 h后小井内外仍可保持0.5 cm以上液面差,证明细胞已形成致密的屏障;(5)荧光素钠透血脑屏障实验结果显示,不同时间点Papp值均小于1X10-6 cm/s,证明建成之屏障对亲水性小分子物质的限制透过作用良好;(6)本实验建立的川芎嗪LC/MS/MS测定法及天麻苷元HPLC测定法专属性强,精密度好,准确度高,基质效应及提取回收率均可达到要求,可用于川芎嗪与天麻苷元体外血脑屏障透过率的测定。(7)高剂量天麻素可明显提高各时间点川芎嗪BBB透过率,中剂量天麻素可明显提高90 min前川芎嗪BBB透过率,低剂量天麻素对川芎嗪各时间点BBB透过率无明显影响;高剂量天麻苷元可明显提高各时间点川芎嗪透过率,低、中剂量天麻苷元对川芎嗪各时间点BBB透过率无明显影响.(8)各剂量川芎嗪可明显提高天麻苷元峰值透过率,高剂量川芎嗪于20 min时即可出现透过率明显提高。结论:(1)HCMEC/D3所建立体外血脑屏障在TEER值稳定性、蛋白表达水平、防止液体渗漏、亲水性小分子物质限制透过性等多个方面均可体现体内血脑屏障特性,故可用于建立体外血脑屏障模型并进行后续透过率实验。(2)天麻素和天麻苷元均可有效提高川芎嗪体外血脑屏障的透过性但所需剂量较大。(3)各剂量川芎嗪可明显提高达峰时天麻苷元透过率。
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