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坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)感染是我国2010年新发生的一种传染性疾病,该病以种鸭、蛋鸭产蛋下降、雏鸭瘫痪为特征。TMUV感染可危害多个品种鸭,包括北京鸭、樱桃谷鸭、绍兴鸭、金定鸭、龙岩鸭和山麻鸭等。依据发病日龄的不同,感染鸭群的死亡率为5～30%,发病率可达90%以上。目前该病在全国水禽养殖地区均有发病和流行,给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。DTMUV是单股正链RNA病毒,其基因组编码3个结构蛋白(衣壳蛋白、前膜蛋白、囊膜蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中E蛋白是坦布苏病毒主要的结构蛋白,在病毒的吸附、穿入、宿主范围、病毒毒力、病毒与细胞膜的融合以及病毒粒子在细胞内的包装过程中发挥着重要作用。此外E蛋白也是重要的抗原分子,包含多个抗原决定簇,可以通过诱发中和抗体产生保护性免疫应答。本研究以期发现与E蛋白相互作用的宿主因子,拓展现有的坦布苏病毒与宿主相互作用网络,为阐述坦布苏病毒的的致病机制,提出新的疾病防控思路提供理论依据。本研究包括以下两个部分:1.鸭胚成纤维细胞c DNA文库的构建取10日龄SPF鸭胚,制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。收集第2代鸭胚成纤维细胞,采用Trizol法提取鸭胚成纤维细胞总RNA。以总RNA为模板,反转录合成c DNA第一链。通过LD-PCR技术合成双链c DNA,经CHROMA SPIN TE-400 column纯化去除小分子双链c DNA后,将纯化的双链c DNA与p GADT7载体连接形成重组质粒。利用同源重组的方法将构建的重组质粒克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的c DNA文库,并对构建的c DNA文库进行鉴定。结果,构建的文库滴度为3×107cfu/m L,文库插入的双链c DNA片段大小为500～2250 bp,平均大小约为1.0 kb,符合酵母双杂交筛选的要求。2.与DTMUV E蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选采用Trizol法提取DTMUV RNA,RT-PCR方法扩增E基因,将E基因与载体p GBKT7分别进行双酶切,酶切产物连接后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,通过抗性筛选获得阳性克隆,提取质粒,进行双酶切鉴定并测序。将构建的诱饵质粒p GBKT7-E和空载体p GBKT7分别转化Y2H感受态细胞,观察其在SD/-Trp平板上的生长情况;将诱饵质粒p GBKT7-E转化Y2H感受态细胞,观察其在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A平板上的生长情况及菌落颜色的变化。利用p GBKT7-E诱饵质粒对鸭胚成纤维细胞c DNA文库进行筛选,得到阳性文库质粒,根据序列比对分析结果。结果,经双酶切鉴定和测序分析,确定诱饵质粒p GBKT7-E构建成功;诱饵质粒p GBKT7-E在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A平板上不能生长,且在SD/-Trp平板上的生长情况与空载体p GBKT7并无太大区别,验证了诱饵质粒p GBKT7-E无自激活活性和毒性;通过酵母双杂交从鸭胚成纤维细胞c DNA文库中筛选得到了ANTX1、PRDX1、PRS7、MORC3等宿主蛋白。