论文部分内容阅读
目的胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,尤其在中国、韩国、日本等东亚国家。尽管胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步,但进展期胃癌的预后依然很差,5年生存率徘徊在20%～30%左右。在过去的几年中,已经证实胃癌的发生发展是多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥重要作用,如细胞粘附、信号传导、细胞分化、细胞增殖及转移。更好的了解胃癌发生发展的分子机制将有利于胃癌的诊治及预防。许多研究表明生长因子不仅促进组织细胞的增殖,而且能诱导组织细胞的恶性转化,他们在人类肿瘤的发展中发挥了重要的角色。中期因子(Midkine,MDK,MK)是肝素结合生长因子家族的成员。人MK基因定位于11p11.2,由5个外显子和4个内含子组成。其启动子区域有视黄酸反应元件,因此视黄酸可诱导胚胎瘤细胞系和某些组织MK的表达。成熟的MK是一种分泌性蛋白,它在妊娠中期胎儿组织中分布广泛,出生后表达水平降低。在正常成人组织中,MK在小肠黏膜高表达,在甲状腺中度表达,在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达,而在肝脏完全不表达。近年来研究发现,MK高表达于多种人类恶性肿瘤,如乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、神经母细胞瘤和Wilm’s瘤等。这与其具有多种生物学功能有关,它不仅在神经发育过程中起到营养及保护作用,还能通过促有丝分裂、促血管生成、诱导细胞恶性转化、抗凋亡等功能影响肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡。目前,关于MK与胃癌的关系研究较少。因此,本研究旨在探讨在人胃癌组织中MK的表达情况,并研究其在胃癌发生、发展过程中的作用及分子机制。方法一、Midkine在人胃癌组织中的表达1、利用免疫组化方法检测MK在胃癌及癌旁组织中的表达。2、利用实时定量PCR技术检测MK在胃癌及其配对癌旁组织中的表达。二、Midkine影响胃癌细胞的增殖1、利用实时定量PCR技术分别检测SGC7901、BGC823、MGC803、MKN1胃癌细胞系中MK表达。2、利用分子克隆方法构建MK逆转录病毒载体,并进行酶切及测序鉴定。3、利用脂质体转染法将MK逆转录病毒载体及空载体转染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得稳定克隆后进行鉴定。4、MK靶向siRNA瞬时干涉人胃癌BGC823细胞内源性MK表达。5、利用MTT法及台盼兰拒染法检测MK高表达对SGC7901细胞增殖的影响。6、利用MTT法检测靶向干涉MK后对BGC823细胞增殖的影响。7、通过软琼脂克隆形成实验检测上调MK对SGC7901细胞克隆形成能力的影响。8、通过裸鼠成瘤实验检测上调MK对SGC7901细胞体内成瘤性的影响。三、Midkine影响胃癌细胞增殖的机制1、利用Western blot检测MK对两条主要生存通路(PI3K/Akt,ERK1/2)的影响。2、利用Western blot检测MK对细胞周期调节蛋白(cyclinA,cyclinB1,cyclinD1,Cdk2,Cdk4,Cdk6)的影响。结果一、Midkine在人胃癌组织中的表达1、免疫组化结果显示:MK在胃癌组织的阳性率为54%,而在癌旁正常组织的阳性率仅为28%(P＜0.05)。2、实时定量PCR结果显示:在19对人胃癌组织及其配对癌旁正常组织标本中,有11例标本MK在胃癌组织的表达为癌旁正常组织的2倍以上(57.7%),而仅有2例标本MK在癌旁正常组织的表达为胃癌组织的2倍以上(10.5%),(P＜0.05)。二、Midkine影响胃癌细胞的增殖1、实时定量PCR结果示:四种胃癌细胞系,按MK mRNA水平由高至低排序为BGC823＞MGC802＞MKN1＞SGC7901。2、经BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切MK逆转录病毒载体得到大小分别为6Kb及400bp左右片段,初步证实载体结构正确,DNA测序后与GeneBank公布的MKcDNA比对证实MK基因序列正确、完整。3、经G418筛选后获得两个MK稳定高表达的SGC7901细胞克隆。实时定量PCR及Western Blot检测结果示,7号和11号克隆MK mRNA及蛋白表达水平均较空载体对照组高5倍以上,且7号克隆高于11号克隆。4、实时定量PCR结果示:10nM及20nM MK siRNA靶向干涉后,BGC823细胞内源性MK表达分别降低了46.9%和74.8%。Western Blot检测结果与实时定量PCR结果一致。5、应用MTT法及台盼兰拒染法绘制的细胞生长曲线示:从72h开始,7号、11号克隆的增殖速率均高于空载体对照组,且7号克隆高于11号克隆。6、应用MTT法绘制的细胞生长曲线表明,从从48h开始,MK靶向干涉组增殖速率明显低于无关序列干涉组,且20nM靶向干涉组低于10nM干涉组。7、集落形成实验表明,三周后7号克隆形成集落最多,其次为11号克隆,空载体对照组形成集落最少。8、裸鼠体内成瘤实验表明,皮下注射三周后无论肿瘤体积还是瘤体重量,7号克隆最大,11号克隆次之,二者均较空载体对照组有显著统计学差异。三、Midkine影响胃癌细胞增殖的机制1、Western Blot结果示:MK高表达的7号、11号克隆,Akt及ERK的磷酸化水平明显上调;相反,在10nM及20nM MK siRNA靶向干涉组,Akt及ERK的磷酸化水平下降。Akt及ERK蛋白水平均无变化。2、Western Blot结果示:MK高表达的7号、11号克隆,细胞周期相关蛋白(cyclinA,cyclinD1,Cdk2,Cdk4,Cdk6)表达水平明显上调;相反,在10nM及20nMMK siRNA靶向干涉组,这些蛋白的表达水平下降。结论1、胃癌组织中MK表达显著高于癌旁正常组织。2、MK能够在体外和体内促进胃癌细胞的增殖。3、MK通过激活PI3K/Akt及ERK1/2两条主要生存通路促进胃癌细胞增殖。4、MK通过上调细胞周期蛋白(cyclinA,cyclinD1,Cdk2,Cdk4,Cdk6)表达,加速细胞周期进展,促进胃癌细胞增殖。