研究背景:腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是指腹主动脉发生形态变化和渐进性扩张,主动脉直径大于3.0 cm或超过预期正常直径1.5倍的疾病。腹主动脉瘤主要在65岁以上男性人群中发病,患病率在1.3%到12.5%之间波动,可导致全世界175000多人死亡,已成为一个重大公共卫生问题。患者在疾病早期动脉瘤破裂前通常不表现特定的症状或体征,一旦瘤体发生破裂死亡率将高达到90%。随着动脉瘤直径的增加,破裂概率显著增加,因此在破裂前进行早期诊断和治疗显得尤为重要。目前腹主动脉瘤的有效治疗方法仍以手术为主,尚未发现用于治疗的特效药物。临床用药只能通过控制血压、心率、血脂等指标来减缓疾病进程。但传统手术治疗存在创伤大、容易引起并发症、死亡率高等特点,因此对直径小于5.0 cm的腹主动脉瘤是否需要进行手术存在争议。深入研究腹主动脉瘤的发病分子机制对早期诊断和治疗方案的开发具有重要意义。细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)主要由胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白和糖蛋白等大分子物质组成,这些分子通过相互连接和交织形成了复杂的网架结构,参与维持动脉壁抗张力强度和一定的弹性。在正常生理状态下,ECM的合成和降解始终能够保持动态平衡,其合成或者降解异常都有可能导致各种功能紊乱和疾病。腹主动脉瘤发病的关键机制之一是蛋白水解活性过高导致ECM成分遭到破坏。与此同时,在腹主动脉瘤发生时动脉壁中膜的主要组成成分--血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)常发生异常凋亡,而VSMC对维持血管壁正常功能及稳定其结构和机械强度起着重要作用。另外在腹主动脉瘤发生时还观察到新生血管形成、单核细胞吞噬以及外膜从先天免疫向适应性免疫转变等炎性变化。总之,腹主动脉瘤的发生和进展涉及众多细胞和分子的功能、数量变化,但具体分子机制尚未阐明。因此有必要进行深入探讨以便于有效治疗策略的发现和新型靶向药物的开发。microRNA(miRNA,miR)是一类长度在18～25个核苷酸的小分子内源性非编码RNA。最近对不同动脉粥样硬化相关的微RNA的发现引发了对心血管疾病诊断和治疗的新见解。通过与靶点mRNA的3’-UTR相互结合导致mRNA的降解或翻译抑制,在转录后水平上抑制基因表达。越来越多的研究表明,microRNA通过调节血管生成相关的细胞生物学功能以及血管生成因子与血管生成过程密切相关,而血管生成因子与动脉瘤、主动脉夹层、动脉粥样硬化、血栓形成、中风等多种心脑血管疾病有关。let-7是发现较早的miRNA家族,在个体发育、细胞增殖、分化、衰老和肿瘤形成等多种生理、病理过程中都起到重要的调控作用。近年来研究指出,let-7在调控心血管疾病中也有着极其重要的作用。特别是在腹主动脉瘤患者的血浆和组织中发现一些let-7家族成员异常表达,这意味着它很可能参与这种疾病发病过程的调控,然而具体的分子机制仍然未知。以往认为let-7作为抑癌基因,可以促进肿瘤细胞的凋亡和衰老过程;与之不同的是,它在血管相关疾病中可能发挥相反作用:已有文献报导let-7过表达可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移以及血管生成过程;另一方面,let-7又广泛抑制胶原酶、MMPs等ECM水解酶的活性从而抑制肿瘤转移。由此,我们推测let-7家族的某些成员可能通过抑制VSMC的异常凋亡和ECM分解,从而控制腹主动脉瘤发病时的发生和进展。实验方法:1.样本采集及检测腹主动脉瘤患者血浆中let-7和基质蛋白酶的表达本实验随机纳入2016年3月到2018年9月期间在济宁市第一人民医院行外科干预的肾下型腹主动脉瘤患者21例(年龄67.2±5.5岁)及对照人群25例(与患者之间在年龄、性别比例方面无统计学差异),所有受试者均行腹主动脉CTA检查确诊。统计患者与健康对照组的一般临床特征,包括年龄、性别比例、BMI、疾病史和药物史等,对比二组之间的差异来评估腹主动脉瘤发生的危险因素。获取手术患者的腹主动脉瘤组织和正常腹主动脉组织,对其进行HE染色观察腹主动脉瘤的病理变化,对组织切片进行EVG染色以进一步观察动脉组织内的纤维结构。2.腹主动脉瘤患者血浆中let-7家族及炎性相关MMPs的表达抽取受试者外周血,离心获得血浆样本。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测得MMP2、MMP-9、MMP-13的血浆浓度。利用定量PCR检测血浆中let-7家族成员(包括 let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-98)的表达量。按照let-7i的中位数,将患者分为高、低表达量两组,比较两组患者的临床特征,分析与let-7i表达量与瘤体直径大小及其他临床特征因素的相关性。3.诱导腹主动脉瘤小鼠模型及let-7i表达量情况ApoE-/-小鼠皮下缓释渗透注射Ang Ⅱ,持续泵入4周诱导腹主动脉瘤动物模型,假手术组小鼠持续泵入PBS缓冲液。4周后通过超声显影检查腹主动脉最大直径进行验证。从小鼠体内分离出腹主动脉组织,利用定量PCR检测模型组小鼠腹主动脉组织中let-7i是否存在异常表达的情况。4.let-7i对小鼠腹主动脉瘤形成及组织中MMPs表达的影响为了研究let-7i下调是否是腹主动脉瘤发生的始动因素,我们使用腺相关病毒包裹的过表达载体(AAV-let-7i mimic)或对照质粒(AAV-mimic NC)腹部注射,对腹主动脉瘤模型小鼠进行干预。在渗透压泵植入前一天开始注射病毒载体,每隔一天注射一次直至动物建模周期结束,第28天将小鼠处死后取材。对比各组小鼠腹主动脉瘤形成率和腹主动脉最大直径,判断let-7i过表达对腹主动脉瘤形成和进展影响。最后,western blot检测组织样品中MMP-2、MMP-9、MMP-13的表达水平。5.let-7i在血管平滑肌细胞中的表达VSMC细胞在受到外界刺激时可以由分化型(收缩型)向去分化型(合成型)转化,以便大量合成胞外基质,修复损伤血管。用10 ng/μl PDGF诱导VSMC细胞去分化型来模拟体内腹主动脉瘤发生时的炎性环境。定量PCR测定不同时间段的let-7i表达情况。6.实验分析let-7i和MMP-9的作用关系利用Targetscan和RegRNA等在线预测工具分析二者可能的作用位点,将预测到的MMP-9基因3’-UTR靶点结合序列克隆到psiCHECK2载体荧光素酶的下游,与let-7各家庭成员的表达载体共同转染HEK293T细胞,检测荧光素酶活性。进一步将let-7i表达载体分别与野生型、突变型MMP-9荧光载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因实验判断两个基因的作用关系。7.let-7i对MMPs的调节作用VSMC细胞中转染let-7i mimic和反义antisense let-7i,分别用来实现let-7i表达上调、下调。定量PCR检测细胞中let-7i的表达水平,评估转染效率。酶联免疫吸附(ELISA)测定let-7i上调、下调对细胞分泌MMP-9的影响。western blot实验检测VSMC细胞内MMP-2、MMP-13蛋白表达量。此外,我们还在人脐静脉内皮细胞HUVEC中转染let-7i mimic、antisense let-7i来过表达、干扰let-7i,ELISA检测转染后MMP-9表达量,对上述结果加以证明。8.let-7i对去分化型血管平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡的影响利用PDGF(10 ng/μl)诱导同步化的VSMC细胞去分化型。48小时后,定量PCR检测let-7i在分化型和去分化型的VSMC细胞中的表达水平。在细胞中过表达、干扰let-7i并用PDGF处理细胞48小时后,通过CCK-8和细胞迁移实验,分别测定let-7i对去分化型VSMC细胞活力、迁移能力的影响。在PDGF处理细胞48小时后,流式细胞仪分析细胞在转染了 let-7i mimic和anti-let-7i后的凋亡情况。随即用western blot实验检测VSMC细胞裂解液中前体和剪切形式的凋亡相关因子活性Caspase-3和Caspase-9的表达来验证上述实验结果。实验结果:1.腹主动脉瘤患者的统计资料及病理变化统计分析结果显示高血压和吸烟是患腹主动脉瘤的主要危险因素(P<0.05)。HE染色结果所示正常组织的内膜、中膜及外膜3层结构层次清晰,结构完整;而腹主动脉瘤壁组织结构紊乱,组织严重破坏,被大量炎性细胞浸润,且中膜层内平滑肌细胞数量明显减少,成纤维细胞明显增多。EVG染色发现正常腹主动脉壁组织内弹力纤维结构完整且呈现波浪形;而腹主动脉瘤组织中,弹力纤维出现断裂且被严重破坏,残留的弹力纤维则部分呈直线形而无波纹。2.腹主动脉瘤患者血浆中let-7家族成员及炎性相关MMPs的表达酶联免疫吸附实验结果显示患者血浆中基质蛋白酶MMP2、MMP-9、MMP-13的表达水平与对照组相比较也相对升高(P<0.05或P<0.01)。与此同时,腹主动脉瘤患者血浆中let-7a、let-7b、let-7c、miR-98表达水平与健康对照相比明显上调(P<0.05或P<0.01),其中let-7i的表达量下调最明显,因此接下来的实验以let-7i家族成员作为研究对象。这些数据表明,let-7家族的一些成员可能在腹主动脉瘤的发生或进展过程中发挥关键作用。3.血浆let-7i表达量与疾病程度的相关性let-7i表达水平与年龄、性别、BMI指数、疾病史和药物史无显著相关性(P>0.05);与let-7i高表达组患者相比,let-7i低表达的患者瘤体直径较大,两组间差异有统计学意义(8.07±0.93 vs 6.32±1.02,P<0.05)。因此推断let-7i可能在腹主动脉瘤的发生、进展中起到调节作用。4.let-7i在腹主动脉瘤小鼠中的表达量下调超声结果证实在Ang Ⅱ持续注射4周后,模型组小鼠的腹主动脉最大直径为1.423±0.109 mm,而假手术组小鼠的主动脉最大直径为0.613±0.012 mm,二者差异显著(P<0.05),表明腹主动脉瘤的动物模型造模成功。另外,小鼠血压从诱导前的102.0±7.4mmHg增加到146.7±9.3 mmHg,且与假手术组小鼠血压有显著差异(P<0.05),模型组和假手术组之间在心率和体重方面无明显变化(P>0.05)。5.let-7i可以控制小鼠腹主动脉瘤形成AAV-let-7i mimic组的小鼠腹主动脉壁中let-7i的表达量明显上升,而其在对照组(AAV-mimic NC)腹主动脉壁中的表达量与未注射小鼠比较却没有明显变化。用let-7i mimic过表达载体干预小鼠后,腹主动脉瘤形成率与未干预的小鼠相比,出现了大幅度下降;而对照载体的引入却不能引起这种变化。通过测量腹主动脉最大直径,我们发现虽然经AngⅡ诱导4周后小鼠的腹主动脉最大直径显著增加,但当同时用携带let-7i mimic的AAV病毒注射时,最大直径大幅度减小,与阴性对照组有显著差异。综上所述,腹主动脉壁中let-7i上调可以抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠腹主动脉瘤形成。6.let-7i过表达可以下调组织中MMPs表达腹主动脉瘤模型小鼠组织中,MMP-2、MMP-9和MMP-13蛋白的表达水平均较正常小鼠明显增多,但当let-7i过表达时,这些蛋白水平显著减少。说明在小鼠模型中,let-7i可以抑制MMPs的表达,这可能是其抑制腹主动脉瘤形成的主要原因之一。7.let-7i在去分化型血管平滑肌细胞中表达量减少定量PCR结果表明,在PDGF诱导48小时后,let-7i在去分化型的VSMC中表达量较未处理细胞有所下降(P<0.05),但当去除刺激条件使let-7i的水平再一次回复,这与我们在患者血浆中得到的检测结果相似,因此我们利用这一细胞模型在体外条件下研究let-7i的相关功能机制。8.let-7i能与MMP-9基因3’UTR靶向结合MMP-9基因3’-UTR与let-7家族各成员之间有保守结合位点。双荧光素酶报告基因实验分析显示,相比于空载体对照,let-7a、let-7b、let-7f和let-7i均可以抑制野生型MMP-9转染组的荧光素酶活性(p<0.01)。并且,我们发现let-7i能够显著抑制细胞荧光强度;而突变型MMP-9组荧光强度没有明显变化,提示let-7i可能与MMP-9编码基因有直接相互作用。9.let-7i 能够下调 VSMC 细胞 MMP-2、MMP-9、MMP-13 的表达let-7i mimic转染的血管平滑肌细胞VSMC细胞中,let-7i表达水平显著上调(P<0.001),而在antisense let-7i转染细胞中let-7i的表达量则显著下调(P<0.01)。说明转染效率较高,可以用于后续功能实验研究。酶联免疫吸附(ELISA)结果表明与对照组相比,let-7i过表达明显降低了细胞培养上清液中MMP-9的表达水平(p<0.01);而抑制let-7i的表达则显著上调了 MMP-9的表达水平(P<0.001)。let-7i过表达还会引起VSMC细胞内MMP-2、MMP-13蛋白表达量减少;而相反,抑制let-7i的表达可以提高MMP-2、MMP-13的表达量。暗示let-7i在VSMC细胞中的作用可能是通过直接与MMP-9基质蛋白酶直接结合并相互作用,使MMP-9和其他一些蛋白酶表达量下降从而保护细胞外基质免受降解。let-7i mimic转染的人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞中MMP-9的表达受到抑制(P<0.01),而anti-let-7i转染的HUVEC中MMP-9的表达显著增强(p<0.001)。10.let-7i能够促进血管平滑肌细胞增殖、迁移CCK-8检测结果显示PDGF刺激48小时后,干扰let-7i表达可以使细胞活力较其阴性对照组明显受到抑制(P<0.01);而let-7i过表达可以使VSMC细胞活力较其对照组有所增加,且差异具有统计学意义(P<0.05)。另外,干扰let-7i表达后迁移的VSMC细胞数量相比于阴性对照组明显减少,而let-7i过表达则可以导致迁移细胞数量显著增加,这些数据说明let-7i可以促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移。11.let-7i抑制血管平滑肌细胞凋亡流式细胞仪分析细胞在转染了 let-7i mimic和anti-let-7i后的凋亡情况。在PDGF处理细胞48小时后,anti-let-7i转染的VSMC细胞凋亡率相比于对照组显著增加;let-7i过表达则可以使细胞的凋亡率大幅降低(p<0.01)。干扰let-7i可以增加活性Caspase-3和Caspase-9的表达(P<0.001);而let-7i过表达则减少了 Caspase活性形式的比例(P<0.001)。这些数据可以说明let-7i显著减轻了去分化型VSMC细胞凋亡,因此可能腹主动脉瘤发展中起到抑制的作用。这些数据可以说明let-7i显著抑制了合成型VSMC细胞凋亡。实验结论:综上所述,我们的实验结果表明let-7i在腹主动脉瘤患者血浆中显著下调,且let-7i过表达可以减轻小鼠腹主动脉瘤的形成及组织中MMPs的表达。体外研究发现,它通过与MMP-9相互作用并抑制其表达,减轻了 ECM降解。另一方面let-7i还参与维持PDGF诱导的去分化型VSMC细胞增殖和迁移作用,并能够抑制VSMC凋亡,从一定程度上有助于VSMC细胞合成胞外基质修补受损血管,这些基质分子与VSMC共同作用以维持血管壁的结构和机械强度。这些结果表明,let-7i很可能是腹主动脉瘤发病机制中的一个重要调节因子,作为诊断和治疗的新的生物标志物。