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目的探讨白藜芦醇(Res)对体外培养的SD大鼠脊髓神经细胞缺血再灌注损伤(spinal cord ischemic-reperfusion injury,SCII)后诱导自噬的影响方法参照刘希伟等人通过在体外培养脊髓神经细胞的成熟方法,本实验在体外培养SD大鼠原代脊髓神经细胞1周。采用Nissl染色法鉴定SD大鼠脊髓原代神经细胞。参考和借鉴林翔等人应用谷氨酸液建立脊髓缺血再灌注损伤的经验,造成大鼠脊髓神经细胞缺血再灌注损伤模型。谷氨酸液浓度分别为50umol/mL组、100umol/mL组、150umol/mL组、200umol/mL组、250umol/mL组;分别在给予不同浓度的谷氨酸液作用脊髓神经细胞10min、15min、20min后,倒置显微镜下观察不同浓度的谷氨酸液作用脊髓神经细胞不同时间后的细胞形态图片。造模成功后,MTT法测定细胞存活率和抑制率,从而明确谷氨酸液造成脊髓神经细胞缺血再灌注损伤的最佳作用浓度和时间。分别配制2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L的白藜芦醇,用MTT法来测定最适合的药物浓度。将培养的脊髓原代细胞随机分为3组:空白对照组,模型组,白藜芦醇实验组,每组64孔,通过Western blot、细胞免疫组化法检测各组脊髓神经细胞中Beclin-1、LC3II/LC3I的表达;用透视电镜观察各组细胞中的自噬体结构。结果倒置显微镜下观察所培养脊髓神经细胞的形态、还有脊髓神经细胞Nissl染色后的图片,可以得出结论我们所培养的细胞纯度在97%以上,并且就是脊髓神经细胞。MTT法鉴定缺血-再灌注损伤模型的结果:当谷氨酸液浓度为150umol/mL、损伤15min时细胞细胞死亡率接近50%,各组间差异有统计学意义。故选用150umol/L的谷氨酸浓度和15min的作用时间,作为实验药物白藜芦醇干预的观察点。采用MTT法测定白藜芦醇的最佳作用浓度:白藜芦醇浓度为8mmol/L时,细胞存活率接近80%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。电镜观察脊髓神经细胞自噬结果:空白组中脊髓神经细胞的胞体正常,核膜、线粒体、内质网等正常。模型组线粒体数目减少,肿胀,出现大量空泡,内质网松散,可见双层膜结构的自噬溶酶体。在白藜芦醇组中,可见双层膜结构的自噬溶酶体,细胞器和细胞完整性的损伤也低于模型组。用免疫印迹检测Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达结果显示:实验组Beclin 1,LC3Ⅱ/Ⅰ表达高于空白对照组,有统计学差异(P<0.05);实验组Beclin 1,LC3Ⅱ/Ⅰ表达高于模型组,有统计学差异(P<0.05);模型组Beclin 1,LC3Ⅱ/Ⅰ表达高于空白对照组,有统计学差异(P<0.05);免疫细胞化学检测LC3和Beclin-1表达:模型组LC3和Beclin-1表达高于空白对照组(P<0.05);实验组的LC3和Beclin-1表达均高于模型组(P<0.05);实验组的LC3和Beclin-1表达均高于空白对照组(P<0.05)。结论实验药物白藜芦醇可减轻大鼠脊髓神经细胞通过谷氨酸液造模的缺血再灌注损伤,此作用与其促进损伤细胞的自噬有关。