第一部分：背景与目的：心肌细胞的凋亡对心力衰竭(心衰)的发生和发展起重要作用。目前对于心衰时心室和心房肌细胞凋亡的调控机理仍不清楚。心衰形成房颤的基质,使房颤更易诱发和维持,并进一步加重心衰。有研究发现microRNA-499(miR-499)能抑制缺血、缺氧时心室肌的凋亡；而心衰患者心室肌凋亡增加且miR-499显著下调。因此,我们拟利用犬心室快速起搏心衰模型,研究microRNA-499对犬心室快速刺激致心衰合并房颤模型中心房和心室肌细胞凋亡的调控机理。方法：经颈内静脉在犬右室植入起搏电极,利用起搏器以240次/min的频率刺激心室制作犬的心衰模型,分别刺激0、24h、1w和2w。用RT-PCR测定各个时间点心室和心房肌细胞的miR-499的表达水平,及心衰、电生理、凋亡和纤维化、氧化应激、凋亡信号通路(p53和PDCD4)等指标。结果：心室快速起搏致心力衰竭模型,刺激时间为0、24小时、1周和2周。正常健康犬(对照组)左室舒张末压(LVDP)接近O mmHg。随VTP时间延长,LVDP逐渐升高；VTP2周后LVDP平均值上升至23.04mmHg,提示充血性心力衰竭,表明动物模型成功建立。随VTP时间延长,各个时间点的心房有效不应期(atrial effective refractory period, AERP)没有显著变化。犬的左心房组织相对表达水平随VTP时间延长而升高的只有miR-21,在刺激1wk时达到峰值(为对照组11.6倍)；相对表达水平随VTP时间延长而降低的是miR-499、423、328和133a,分别降至对照组的0.137(1wk)、0.173(1wk)、0.215(2wk)、0.144(1wk)。但是miR-1和miR-126的相对表达水平未检测出。在犬的左心室组织,VTP后相对表达水平随VTP时间延长而升高的只有miR-21,在刺激2wk时达到峰值(为对照组3.96倍)；相对表达水平随VTP时间延长而降低的是miR-499、423、328、133a、1,分别降低至对照组的0.472(1wk)、0.435(24hr)、0.485(2wk)、0.459(24hr)、0.381(2wk)。miR-126的相对表达水平未检测出。该结果提示miRNAs的表达变化,心房比心室更显著,而且miR-499下降最为显著,表明其在心衰合并房颤模型的调控中起关键作用。PDCD4作为miR-499的靶基因,在本实验中随刺激时间延长表达量升高,而且在左心房比左心室升高显著,可能原因是心房凋亡更为严重,提示PDCD4是miR-499调控心肌细胞凋亡的重要环节。但p53未观察到有明显变化。随刺激时间延长,心房和心室的凋亡都逐渐加重,纤维化也随之加重。心房的纤维化较心室更为严重,表明心房较易发生房颤的结构基础,构成房颤发生的基质。相应的调节纤维化的microRNA-miR-21在心房和心室显著升高,在心房升高更明显。这与前人研究结果一致。心力衰竭过程中,心房和心室肌的凋亡与氧化应激有关,且随时间延长,氧化应激程度越重。结论：据此,我们认为miR-499能抑制心衰时心肌凋亡,凋亡过程有miR-499的靶基因PDCD4参与。心衰合并房颤时,心房miR-499下调,miR-499通过调控其靶基因PDCD4,参与心房的凋亡；miR-21在心房显著升高,参与纤维化过程。氧化应激和纤维化在心室快速刺激致心衰模型中起重要作用。通过本课题进一步明确了心衰及伴随房颤时miR-499调控细胞凋亡的信号通路,并为利用miR-499开发防治心衰以及心衰合并房颤的药物提供依据。第二部分：背景与目的：MicroRNA (miRNA, miR)近年来发现其在心房颤动(房颤)的病理生理机制中起重要的作用,房颤是临床最常见的心律失常,目前已发现多种与房颤相关的miRNA,参与了电重构和结构重构的调控。循环miRNA具有良好的稳定性,作为疾病的临床标记物具有广阔的前景,但对房颤患者循环miRNA的研究尚未见报道。本实验拟利用microRNA芯片和mRNA芯片研究持续性房颤与阵发性房颤患者循环miRNAs表达谱的改变,且进行数据分析,为进一步探讨miRNA对房颤的调控作用提供依据。方法：分别收集持续性房颤、阵发性房颤患者和健康对照的全血各5例,用TRIzol法提取血清总RNA,并进行质量和浓度检测,将提取的RNA进行标记,然后用miRCURYTM LNA microRNA芯片和mRNA芯片进行杂交。microRNA芯片杂交结果扫描后,得到的miRNA表达谱数据进行标准化分析,找出差异表达的miRNAs,并进行聚类分析。然后进行两分类的差异基因筛选—-TwoclassDif,对有差异的：miRNAs和mRNA进行RT-PCR验证。结果：和健康对照相比,持续性房颤患者和阵发性房颤患者血清中表达都有明显差异的miRNA共有13个。其中表达上调的有8个：hsa-miR-3169, hsa-miR-3612, hsa-miR-634, hsa-miR-376a, hsa-miR-517b, hsa-miR-377*, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-664;表达下调的有5个：hsa-miR-1, kshv-miR-K12-5, hsa-miR-378c, hsa-miR-204, hsa-miR-27a,其中差异倍数最大的是hsa-miR-3169和hsa-miR-3612,均超过4倍,但这两个miRNAs的功能尚未见报道。前人所报道过的房颤时改变显著的miRNAs,如miR-517b和miR-664表达上调,miR-1表达下调,与前人研究结果一致。而其他一些报道过的在心房颤动时表达水平改变显著的miRNAs(如miR-328、 miR-499),在本次实验检测中并未发现显著的差异。结论：持续性房颤与阵发性房颤患者循环miRNAs表达谱和相应的mRNAs有显著改变,为研究miRNAs在房颤中的作用机制,以及miRNAs作为房颤的治疗靶点奠定了基础。第三部分：背景与目的：脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)因其自我复制能力、多向分化与免疫调节潜能,而被认为是再生医学的一个良好细胞来源。基于这个背景,本实验的目的是在体外研究传统中药地黄低聚糖(Rehmannia glutinosa Oligosaccharide, RGO)对人ADMSCs的增殖、H202诱导的凋亡、以及分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)的影响。主要方法：体外分离人ADMSCs,行流式细胞术检测细胞的表面标记,绘制MTT生长曲线检测细胞增殖情况。用ELISA试剂盒检测VEGF和HGF的分泌。结果：流式细胞学发现人ADMSCs对CD90和CD29表达阳性,但是CD31、CD34和CD45表达阴性。实验表明RGO不但能够促进细胞生长,而且能减轻H202诱导的人ADMSCs的凋亡。RGO的保护作用机制可能与VEGF和HGF的上调有关。结论：本研究表明RGO可增加人ADMSCs的细胞活性和增殖能力,并且能减轻H202诱导的细胞凋亡。RGO可能是通过促进人ADMSCs旁分泌释放VEGF和HGF而起作用的。这些结果提示RGO能增加干细胞活力,改善其效果,从而将在细胞疗法中得到广泛应用。